Giáo trình Công nghệ tế bào thực vật (Phần 2)

 Chƣơng 5. NUÔI CẤY TẾ BÀO TRẦN 
5.1. Giới thiệu chung về nuôi cấy tế bào trần 
Việc giới thiệu về quy trình sử dụng enzyme để cô lập tế bào trần thực vật 
(Cooking 1960) đã đƣa ra một bộ mặt mới đầy hứa hẹn cho tế bào thực vật và nuôi 
cấy mô và mở ra một lĩnh vực mới trong sinh học tế bào thực vật. Điều làm cho tế bào 
trần có tác động mạnh nhƣ một hệ thống thí nghiệm đó là hệ enzyme phân hủy vách tế 
bào làm lộ ra bề mặt màng tế bào nhƣ là một rào cản giữa môi trƣờng bên ngoài và 
thành phần bên trong tế bào. Sự tiếp cận đến màng sinh chất có ý nghĩa là thí nghiệm 
có thể đƣợc thiết lập để nghiên cứu và thao tác trên các thuộc tính của màng tế bào 
điều mà không thể thực hiện đƣợc khi bị bao phủ bởi vách tế bào. Tế bào trần đƣợc sử 
dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực thí nghiệm từ nghiên cứu những tính chất vật lý 
của màng sinh chất (Ruesink 1973) đến những nghiên cứu nhập bào và hấp thu các 
phần tử (Willison et al. 1971), các bào quan (Potrykus 1975) và vi sinh vật (Davey và 
Power 1975). Hơn thế nữa, do tính sẵn sàng có thể sử dụng tế bào trần cho các 
phƣơng pháp phá vỡ tế bào để nhanh chóng thâu nhận các bào quan và các đại phân tử 
mà không gặp phải sự biến dạng hƣ hỏng nhƣ các phƣơng pháp ly trích thông thƣờng 
(Howland et al. 1975). Rất dễ nhanh chóng nhận thấy rằng các tính chất của màng 
sinh chất dƣới một số điều kiện thuận lợi nào đó có thể chịu sự dung hợp và có khả 
năng hình thành tế bào lai, cuối cùng dẫn đến sự tạo ra tế bào lai sinh dƣỡng liên quan 
đến sự cải thiện năng suất thu hoạch mùa vụ (Nickell và Torey 1969). Do mỗi một tế 
bào cách ly với tế bào khác trong quần thể tế bào trần và là một hệ thống đơn bào nên 
có thể thao tác tƣơng tự nhƣ quần thể vi sinh vật. Tính chất này đƣợc khai thác thành 
công trong thí nghiệm cho nhiễm đồng loạt bởi virus (Takebe 1975), nuôi cấy nhân 
giống vô tính tế bào và phân lập các tế bào đột biến. 
Giai đoạn chính trong sự phục hồi trở lại của tế bào trần trong môi trƣờng nuôi cấy tế 
bào nguyên vẹn là quá trình tổng hợp và phát sinh trở lại vách tế bào. Tế bào trần phân 
lập từ mô quả cà chua đƣợc khảo sát chi tiết đầu tiên quá trình cung cấp enzym để 
phục hồi trở lại vách tế bào (Pojnar et al. 1967). Mặc dầu báo cáo đầu tiên về enzyme 
phân lập của tế bào trần đƣợc công bố vào năm 1960 (Cocking 1960) nhƣng mãi đến 
10 năm sau sự phân chia tế bào đầu tiên từ tế bào trần mới đƣợc báo cáo (Nagata và 
Takebe 1970) thí nghiệm khảo sát trên tế bào thịt lá thuốc lá tái tạo nhanh chóng vách 
tế bào mới và khoảng 60-80% số tế bào có vách mới đã phân cắt tế bào trong môi 
trƣờng nuôi cấy. Mô sẹo đƣợc hình thành thúc đẩy sự tạo thành cành non rồi sau đó là 
cây thuốc lá nguyên vẹn (Takebe et al. 1971). Cùng thời gan ấy Kao et al. (1970) quan 
sát sự tái tạo và phân chia ở tế bào trần cây đậu nành trong môi trƣờng nuôi cấy. Cuối 
năm 1970 đã chứng minh rõ nuôi cấy tế bào trần để tạo tập đoàn tế bào và cuối cùng 
là cây hoàn chỉnh đã trở nên là quy trình trong nhiều phòng thí nghiệm, và có nhiều 
loài đã đƣợc nhân bội ổn định. Tuy nhiên, còn có một số vấn đề cần khắc phục đƣợc 
nêu ra do Evans và Cocking (1978) đó là môi trƣờng nuôi cấy, yếu tố vật lý môi 
trƣờng, và yếu tố di truyền. 
Một trong những lý do protoplast không rời nhau ra là bề mặt tế bào có tích điện và 
chúng có khuynh hƣớng kết dính với nhau. Nghiên cứu bằng điện di có thể xác định 
bề mặt tế bào có tích điện (Grout and Coutts 1974) và có thể trong một số điều kiện 
thông thƣờng nào đó điện tích này là âm. Một trong những điều kiện tất yếu của yếu 
tố làm tan rã các tế bào là làm giảm thiểu điện tích này xuống làm cho tế bào tập hợp 
lại và màng tế bào sát lại gần nhau hơn. Một trong những hợp chất đầu tiên đƣợc ghi 
nhận gây ra sự tan rã là nitrate sodium (Power et al. 1970). Tế bào bóc trần để vào 
dung dịch muối này sẽ nhanh chóng đƣa đến sự kết tập lại, và thông qua việc khảo sát 
sự chuyển động của tế bào trần trong buồng điện di cho thấy rõ nitrate sodium giảm 
thiểu điện âm của tế bào trần (Grout và Coutts 1974). Polyethylene glycol (PEG) đƣợc 
chấp nhận rộng rãi nhƣ một tác nhân gây ra sự tan rã (Kao và Michayluk 1974, Wallin 
et al. 1974); xử lý tế bào trần với PEG gây ra một sự kết tập nhanh chóng với tế bào 
trần thực sự tan rã xãy ra trong thời gian hydrat hoá trở lại kết hợp với sự gỡ bỏ của 
PEG. Sự sử dụng nitrate sodium để thúc đẩy sự hoà nhập dẫn đến sự tạo thành tế bào 
lai thực vật về mặt di truyền, ví dụ khối u lai giữa Nicotiana glauca và Nicotiana 
langsdorfii do Carlson và cộng sự (Carlson et al. 1972). Những tiến bộ nỗi bật về yêu 
cầu phát triển những quy trình chọn lọc các tế bào lai sinh dƣỡng độc lập của các 
thuộc tính bất kỳ đã biết của lai hữu tính. Do vậy những nỗ lực hƣớng trực tiếp đến 
việc sử dụng các đột biến, và sử dụng những chọn lọc trên căn bản sự khác biệt xảy ra 
giữa tăng trƣởng thực vật tự nhiên và đáp ứng với môi trƣờng dinh dƣỡng và thuốc. Ở 
Nottingham Petunia đƣợc chọn cho những đánh giá này bởi vì đáp ứng của chúng đối 
với mô nuôi cấy và sự di truyền màu sắc cánh hoa đƣợc ổn định. Thực vật lai sinh 
dƣỡng của Petunia hybrida và P. parodii đã đƣợc tạo ra thành công vào năm 1976 
(Power et al. 1976). Nhƣ đã đƣợc thảo luận bởi Cocking (1989), những thành công khi 
sử dụng các đối tƣợng của họ cà Solanaceae không tiến hành song song với thành 
công trong nuôi cấy tế bào trần ngũ cốc. Điều đáng nói là hơn hai mƣơi năm sau 
không một ai đạt đƣợc sinh sản ổn định tế bào trần lá ngủ cốc. Thành công chỉ đạt 
đƣợc trong mƣời năm gần đây trong việc tái tạo cây nguyên vẹn từ tế bào trần lúa, cô 
lập không phải từ lá nhƣng từ dịch treo nuôi cấy tế bào (Abdullah et al. 1986). Thành 
công ban đầu khi lấy tế bào trần của cây thuốc lá và cây Petunia để tái tạo vách tế bào 
rồi trải qua sự phân chia để tạo thành mô sẹo, sau đó phân hóa thành cơ quan để tạo 
thành rể và chồi non, làm lộ ra con đƣờng nghiên cứu sai về các loại cây ngủ cốc. 
Năm 1980 đã nhìn thấy đƣợc phƣơng pháp tinh vi mở rộng trong tái tạo lại cây 
nguyên vẹn từ gia tăng vững chắc số các loài cây và trong sản xuất tế bào lai sinh 
dƣỡng và cybrids, bao gồm ví dụ nhƣ các cá thể khác loài không có khả năng giao 
phối, Petunia parodii và Petunia parviflora (Powder et al. 1980). Quy trình đƣợc phát 
triển để tái tạo lại cây nguyên vẹn từ tế bào trần cô lập, không chỉ cho cây lúa, nhƣng 
còn ở cà chua, đậu nành, hạt lanh, cải bắp, rau diếp và các cây lai sinh dƣỡng giữa các 
loài khác nhau, có bộ máy di tuyền khác nhau của Lycopersicon, Nicotiana, Solanum, 
Glycine, Citrus, Brassica, Medicago và Trifolium spp (Bajaj 1989a). Thêm vào đó các 
quy trình đƣợc phát triển xa hơn cho các kỹ thuật vi tiêm, dung hợp bằng điện, flow 
cytometry, hấp thu và tích hợp DNA, cô lập nhân và nhiễm sắc thể từ tế bào trần 
(Bajaj 1989b). 
Việc khám phá ra tế bào trần có thể bị nhiễm bởi virus khảm thuốc lá (Cocking and 
Pojnar 1969) kích thích sự quan tâm về vấn đề hấp thu vào hệ thống tế bào trần, mà 
đỉnh điểm là sự biểu hiện của plasmid Ti trong vi khuẩn Agrobacterium gây khối u, 
đƣợc đƣa và tế bào trần để biến đổi tế bào trần, cung cấp bằng chứng đầu tiên về vai 
trò độc lập của plasmid Ti ở khía cạnh này (Davey et al. 1980). Điều này mở đƣờng 
cho việc sử dụng plasmid chuyển nạp trực tiếp cho tế bào trần dẫn đến việc tạo ra 
đƣợc các loại rau và ngũ cốc chuyển gen và các vụ thu hoạch cây trồng bằng chuyển 
nạp trực tiếp DNA cho tế bào trần, bao gồm các loại lúa chuyển gen có khả năng sinh 
sản theo phƣơng cách chuyển nạp bằng điện xung vào tế bào trần lúa plasmids 
chimaeric (Zang et al. 1988). 
Những nghiên cứu trên cây lúa chuyển gen minh họa vai trò của tế bào trần trong việc 
biến đổi tế bào ngũ cốc và làm cho vấn đề phân tử và tế bào tiếp cận nhau hơn. Khảo 
sát trên một vài chi tiết minh họa các nghiên cứu này đã phát triển nhƣ thế nào trong 
thập niên 1980. Sự tƣơng tác giữa virus với tế bào trần cô lập minh chứng poly-L-
ornithine kích thích sự lây nhiễm, trong khi các nghiên cứu tiếp theo xác nhận rằng 
PEG cũng gia tăng sự thu hút virus và acid nhân của virus vào trong tế bào trần 
(Davey và Kumar 1983). Rồi sau đó những năm cuối thập niên 1970 đầu thập niên 
1980 đây là thời gian phối hợp giữa các kỹ thuật xác định plasmid Ti có thể chuyển 
nạp hay không vào tế bào trần thực vật. Nhƣ đã đề cập trƣớc đây các nghiên cứu bao 
gồm sự tƣơng tác của cấu trúc siêu xoắn của plasmid Ti từ dòng octopine của A. 
tumefaciens với dịch treo tế bào trần Petunia hybrida với sự có mặt của PLO, kết quả 
tạo ra một tập đoàn tế bào trần có biểu hiện tính chất có vị đắng của đỉnh tăng trƣởng 
trong môi trƣờng có hormone tự do và sự tổng hợp octopine, cả hai đều mã hoá bởi 
gen Ti T-DNA (Davey et al. 1980). Deshayes et al (1985) đóng gói pGV23 NEO, đây 
là một plasmid mang gen aminoglycoside phosphotranspherase type II (APH II; 
neomycin phosphotranspherase, NTP II) từ Tn5 có khả năng kháng kanamycin trong 
tế bào thực vật, vào trong thể tích chất béo (liposome) và dung hợp với plasmid có 
chứa túi của tế bào trần thuốc lá sử dụng PEG. Tập đoàn tế bào kháng kanamycin 
đƣợc cô lập ở 4.0´105. Mẫu cắt hạn chế DNA đƣợc chèn vào trong quá trình chuyển 
gen vào tế bào thực vật đƣợc chỉ định theo cách tích hợp kế nhau trong trình tự của 
plasmid, bao hàm sự tái tổ hợp đồng dạng giữa các trình tự trong khi chuyển nạp. 
Tiến bộ chính trong chuyển nạp trực tiếp DNA vào tế bào trần đạt đƣợc khi nó đƣợc 
chứng minh rằng trình tự T-DNA là không cần thiết cho sự chuyển nạp ổn định và 
biểu hiện của DNA lạ trong tế bào thực vật. Một gen lai có thể chọn lọc bao gồm vùng 
giải mã của gen Tn5 NPII dƣới sự kiểm soát của gen promoter CaMV VI đƣợc đƣa và 
tế bào trần thuốc lá nhƣ là một phần của E. coli (pABCD1) bằng cách xử lí hỗn hợp tế 
bào trần - plasmid bằng PEG 6000. Tập đoàn đã chuyển nạp sẽ đƣợc chọn lọc trong 
môi trƣờng có chứa 7 mg/ml kanamycin. Gen lạ sẽ đƣợc truyền qua cho thế hệ cây 
con bằng phép lai Mendel. 
Trong khi tế bào trần thuốc lá đƣợc sử dụng rộng rãi nhƣ một hệ thống tiêu biểu cho 
các nghiên cứu DNA, các hệ thống tế bào trần khác, bao gồm lúa, cũng đƣợc quan tâm 
rộng rãi. Chuyển nạp gen hữu thụ cho Brassica napus đƣợc chuyển gen bởi pABD1 
vào trong tế bào trần thịt lá bằng phƣơng pháp xung điện (Guerche et al. 1987). Tính 
kháng kanamycin đƣợc truyền qua thế hệ cây con qua con đƣờng hữu tính bởi lai một 
tính Mendel. Chuyển gen trực tiếp cũng chứng minh khả năng tạo hạt rau Vigna 
aconitifolia kháng kanamycin mô sẹo tái tạo từ tế bào trần sốc nhiệt xử lý bởi PEG và 
pLGV NEO 2103 (Kƣhler et al. 1987). Các nghiên cứu chuyển gen trực tiếp vào tế 
bào trần thực vật cũng cung cấp một hệ thống để quan sát sự biểu hiện gen trong 
khoảng thời gian vài giờ xử lý chuyển nạp. Các nghiên cứu biểu hiện gen tạm thời 
(ngắn ngủi) nhƣ vậy có ích trong việc đánh giá cấu trúc và gen khởi động khi gen 
reporter sẵn sàng có thể thử nghiệm ví dụ nhƣ CAT và b-glucurionidase. 
 Rất hữu ích khi so sánh một vài tính chất chuyển nạp của tế bào trần thực vật và tế bào 
động vật. Thật vậy sự thúc đẩy để lƣợng định tính khả chuyển DNA trực tiếp vào tế 
bào thực vật, đặc biệt là tế bào thực vật đã đƣợc loại bỏ vách tế bào bằng enzym nhƣ 
trong trƣờng hợp tế bào trần thực vật, từ các báo cáo nuôi cấy mô tế bào động vật cho 
thấy có khả năng chọn và biểu hiện một nhóm gen và hệ gen DNA. Bây giờ cơ hội 
xuất hiện các thế hệ đột biến do đƣa các đột biến gen vào tế bào trần thực vật tƣơng 
tác với DNA; đó là các bằng chứng chứng tỏ rằng các mẫu DNA lớn có thể đƣa vào 
và biểu hiện ở tế bào động vật (Allshire et al. 1987). 
Tế bào trần có thể cô lập bằng enzyme từ một số nhóm tế bào ví dụ nhƣ từ tế bào biểu 
bì lá của thuốc lá rồi có thể tái tạo lại thành cây nguyên vẹn (Davey et al. 1974). Lông 
hút của rễ là sản phẩm tự nhiên của tế bào biểu bì rễ, và nó đã đƣợc chứng minh xử lý 
bằng enzyme có thể làm tiêu hủy đỉnh sinh trƣởng của lông hút và phóng thích tế bào 
trần (Cooking 1985). Tế bào trần cô lập từ rễ cây con, thân lá mầm, và lá mầm của 
Lotus corniculatus (sen) sẵn sàng phân chia trong môi trƣờng nuôi cấy để tạo ra mô 
sẹo và từ đó có thể sinh ra tế bào trần (Ahuja et al. 1983) điều đáng quan tâm là xác 
định tế bào trần từ lông hút rễ còn giữ tính chất nguyên thủy hay không. Xử lý rễ của 
cây con Lotus corniculatus với cellulase và pectinase phóng thích các tế bào trần của 
đầu rễ lông hút khi ủ trong môi trƣờng có enzym khoảng 1 phút. 10% của tế bào trần 
phân chia để tạo ra một tập đoàn tế bào mà sau đó tạo đƣợc chồi non. Cây tái tạo có 
kiểu hình và tế bào bình thƣờng. Các nghiên cứu trong tƣơng lai sẽ có thể làm cho một 
hệ thống nhƣ vậy đƣợc sử dụng để xác định nguồn gốc của tế bào trần có ảnh hƣởng 
hay không đến con đƣờng phát triển sau đó. Trong các tế bào trần cô lập từ dịch nuôi 
cấy để tái tạo cây nguyên vẹn cho thấy xãy ra qua sự phát sinh phôi dinh dƣỡng 
(Abdullah et al. 1986). Có thể chăng thay đổi con đƣờng phát triển này bằng kỹ thuật 
điện cao thế trong quá trình phân bào của dẫn suất tế bào trần thực vật nhƣ đã quan sát 
bởi Rech et al. (1987). Gần đây, Chand et al. (1988) quan sát thấy sự bóc trần tế bào 
cây dƣợc liệu thân gỗ Solanum dulcamara ở điện áp 250 đến 1250 vol/cm2 trong ba 
xung điện kế tiếp nhau mỗi xung kéo dài 10 - 50 ms đã kích thích sự tăng trƣởng của 
mô dẫn suất từ tế bào trần và cho thấy có gia tăng khả năng biệt hóa (Chand et al. 
1988). Sẽ rất quan trọng để mở rộng các nghiên cứu này trên hệ thống tế bào trần. Sẽ 
có ích khi tế bào trần Physcomitrella tái tạo chỉ sản sinh một khối u khi đáp ứng với 
ánh sáng đơn cực, và tế bào phân cực này phân chia sau 24 giờ từ tế bào trần cô lập, từ 
hai tế bào con có hai mặt phát triển khác nhau (Jenkin và Cove 1983). Biến đổi con 
đƣờng phát triển có thể cung cấp đầu mối giải mã về sự phát triển tế bào thực vật, tế 
bào của nó và điều khiển phân tử. 
Có lẽ vấn đề quan tâm chính là sự tƣơng tác mới lạ giữa các đại phân tử, viruses và vi 
sinh vật và màng tế bào của tế bào trần. Điện xung để hình thành các lổ trên màng tế 
bào có thể đƣợc dùng để khảo sát theo hƣớng này. Hơn nữa, điều chủ yếu không phải 
là tất cả vách tế bào phải đƣợc bỏ đi; một lợi ích của nghiên cứu trên nhiều mảng. Nhƣ 
đã khám phá ở hoa sen Lotus rất dễ bỏ đi vách tế bào một cách nhanh chóng ở đầu 
lông hút của rễ bằng xử lý rễ cây con với một hỗn hợp cellulase và pectinase. Gần đây 
chúng ta đã quan sát cấu trúc nốt sần tạo ra ở rễ lúa, rễ cây con của cây cải cho dầu khi 
xử lý rễ với hỗn hợp enzyme cellulase và pectinase và cho nhiễm Rhizobium hay 
Bradyrhizobium (Al-Mallah et al. 1989 và 1990). Các nghiên cứu này bao gồm sự 
phân hủy một phần vách tế bào làm lộ ra một phần màng sinh chất của tế bào biểu mô 
có ý nghĩa quan trọng cho việc nghiên cứu sự cộng sinh của Rhizobium đối với các 
cây trồng không phải họ đậu (Cooking và Davey 1991). 
5.2. Phương pháp tách protoplast 
Có 3 phƣơng thức phân lập protoplast, đó là: 
- Cơ học (không dùng các enzyme). 
- Sử dụng enzyme tuần tự (qua hai bƣớc). 
- Sử dụng hỗn hợp enzyme (xử lý đồng thời). 
Phƣơng pháp cơ học tiến hành dựa trên cơ sở phá các mối liên kết  ... , sau đó tách 
và nuôi cấy chồi đỉnh hoặc sử dụng trong vi ghép. 
Tỷ lệ sạch bệnh của mẫu phụ thuộc vào thời gian xử lý nhiệt độ tới hạn và phụ 
thuộc vào khả năng chịu nhiệt của giống (Converse và Tanne, 1984; Lozoya-Saldana 
và Merlin -Lara, 1984). Xử lý nhiệt có tác dụng tốt với đa số trƣờng hợp, song đôi khi 
mô tế bào của cây nhiễm virus nhƣng không bị loại trừ ở nhiệt độ cao do chủng virus 
vẫn có khả năng sinh sản ở nhiệt độ này (Dawson, 1976). 
Kết hợp xử lý nhiệt độ thấp với nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng đã đƣợc sử dụng thành công 
để loại trừ virus khỏi khoai tây và hoa cúc (Paduch-Cichal và Kryczynski, 1987). Bên 
cạnh đó, ngƣời ta sử dụng kết hợp một số hoá chất ức chế virus nhƣ ribavirin, 
vidarabine có gốc adenine để tạo giống sạch bệnh (Cassells và Long, 1980; Stone, 
1982). Các hoá chất chống virus thƣờng độc cho mô cây nên ứng dụng của kỹ thuật 
này vẫn còn hạn chế. 
7.3.3. Nuôi cấy đỉnh phân sinh 
Ngƣời ta đã chứng minh đƣợc rằng nồng độ virus trong thực vật giảm dần ở bộ 
phận gần đỉnh sinh trƣởng riêng đỉnh phân sinh thì hoàn toàn sạch virus. Thực tế này 
đã đƣợc ứng dụng để làm sạch virus bằng cách tách đỉnh sinh trƣởng ở điều kiện vô 
trùng rồi nuôi cấy chúng thành thực vật hoàn chỉnh. Việc phân lập đỉnh phân sinh có 
kích thƣớc 0,01-0,1 mm rất khó khăn và việc tái sinh thành cây hoàn chỉnh cũng chỉ 
đạt đƣợc với tần số rất thấp (0,2-5%) vì vậy ngƣời ta thƣờng phân lập cả chồi ngọn và 
gọi nó là đoạn đỉnh (shoot tips) có kích thƣớc từ 0,1- 1 mm qua đó tính sạch bệnh của 
mẫu vật nuôi cấy bị giảm xuống nhƣng tốc độ tái sinh cây đƣợc tăng lên và đó chính 
là phƣơng pháp đƣợc ứng dụng trong thực tiễn. 
Khái niệm sạch virus của thực vật không có nghĩa là cần phải có đỉnh phân sinh 
hoàn toàn sạch, các phần tử virus mà nó đƣợc hoàn thiện trong quá trình phân hóa của 
các tế bào chƣa phân hóa. Vì vậy, trong thực tiễn phải giới hạn nồng độ virus và khối 
lƣợng mô phân hóa ở một mức nhất định nếu cần có thực vật sạch virus. Việc phối 
hợp xử lý nhiệt với nuôi cấy đỉnh phân sinh là phƣơng pháp rất thuận lợi bởi vì thông 
qua xử lý nhiệt quá trình sinh sản của virus trong chồi ngọn bị ức chế mạnh và thông 
qua quá trình phân hóa đỉnh phân sinh tính sạch virus sẽ đƣợc đảm bảo với độ xác suất 
cao, ở đây không đề cập đến vấn đề chọn các môi trƣờng thích hợp. Thông thƣờng 
ngƣời ta xử dụng môi trƣờng Murashige-Skoog hoặc White. Theo quan điểm lý thuyết 
và kinh nghiệm thực tiễn ngƣời ta thu đƣợc những kết quả khác nhau trong từng 
phòng thí nghiệm, nếu việc nuôi cấy đỉnh phân sinh đƣợc thực hiện trên quan điểm 
sản xuất lớn thì cần phải chú ý những mặt sau đây: (a) đảm bảo độ đồng nhất của 
giống trong tất cả các khâu nuôi cấy, (b) đảm bảo tốc độ sinh trƣởng nhanh và đều đối 
với một số lƣợng đỉnh phân sinh lớn đồng thời (c) kết quả đƣa cây ra đất cũng cần 
phải đƣợc bảo đảm. Các đỉnh sinh trƣởng sau khi phân lập cần đƣợc nuôi ở các buồng 
nuôi cây hoàn toàn khống chế về mặt khí hậu: nhiệt độ 22oC và 16 giờ chiếu sáng ở 
1.000-3.000 lux . 
Khi đƣa cây tái sinh từ đỉnh phân sinh ra ngoài đất cần phải phủ nilon để chúng 
thích nghi dần với độ ẩm không khí thấp. Tốt nhất là nên trồng ở các buồng nuôi cây 
cách ly có thông khí và hoàn toàn sạch rệp lá. Từ tháng 10 đến tháng 3 cần phải chiếu 
sáng thêm, nhƣng trong mùa hè lại phải che bớt ánh sáng. 
7.4. Kết quả trong thực tiễn sản xuất 
7.4.1. Tạo các giống cây sạch bệnh 
7.4.1.1. Cây khoai tây 
Khoai tây là cây trồng ở châu Âu đƣợc nhân giống vô tính và bị virus phá hoại 
nhiều nhất. Trong thời gian qua việc làm sạch virus ở khoai tây mới đƣợc ứng dụng 
một cách chậm chạp trong quá trình duy trì giống. Ngƣời ta chú ý nhiều nhất tới việc 
tạo ra các cây giống sạch bệnh bằng qui trình thử virus và trồng ở các khu vực sạch 
bệnh để tránh tái nhiễm thông qua các loài rệp lá. Qui trình đƣợc sử dụng chủ yếu là 
giết các cây thảo có thể truyền bệnh vào củ khoai tây. Qui trình này có thể nâng cao 
hiệu suất thông qua xử lý nhiệt và nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng. Quá trình xử lý nhiệt 
giữa 32 và 38oC trong thời gian 7 ngày đến 7 tuần và sau đó nuôi cấy đỉnh phân sinh 
có thể loại trừ đƣợc virus A, xoăn lá, X và Y trong khi virus M và S cũng đƣợc giảm 
đi một cách đáng kể. 
Các ảnh hiển vi điện tử của đỉnh sinh trƣởng khoai tây có độ lớn từ 80-100 µm 
cho thấy chúng vẫn còn chứa trong tiêu bản tới 12 thể virus X. Tuy vậy, sau quá trình 
phân loại từ các đỉnh phân sinh đó vẫn thu đƣợc một tỷ lệ phần trăm nhất định các cây 
sạch virus. 
7.4.1.2. Cây thức ăn gia súc 
Để sản xuất hạt giống cây trồng làm thức ăn gia súc, ví dụ cỏ ba lá cần phải có 
cây bố mẹ sạch bệnh virus để tránh sự lây bệnh thông qua hạt giống và đảm bảo thu 
đƣợc năng suất hạt cao. Ngƣời ta nghiên cứu nhiều phƣơng pháp làm sạch virus khác 
nhau. Xử lý lạnh và nuôi chồi ngọn mang lại tốc độ sinh trƣởng cao, nhƣng chỉ sạch 
virus từng phần, nếu xử lý nhiệt kết hợp với nuôi cấy đỉnh phân sinh thì thu đƣợc phần 
lớn các cây sạch virus. 
7.4.1.3. Cây hoa bia 
Các loại bệnh virus ở hoa bia thƣờng làm giảm năng suất đáng kể. Tiến hành 
chọn lọc bằng mắt thƣờng, xử lý nhiệt và nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng, cải tiến dần tình 
trạng sạch bệnh ngƣời ta đã giải phóng 66% cây khỏi virus hop-mosaic (HMV) và 
latent bằng nuôi cấy đỉnh phân sinh, sau đó làm sạch virus prumis necrotic ringspot 
(PNRV) bằng xử lý nhiệt trong thời gian 10 ngày. 
7.4.1.4. Cây rau 
Hầu hết các loài rau trừ một vài trƣờng hợp ngoại lệ đều đƣợc nhân giống bằng 
hạt. Truyền bệnh virus qua hạt vừa mới đƣợc chứng minh ở loài virus gây bệnh khảm 
ở xà lách và đậu (đậu ăn quả trắng hoặc xanh), vì vậy ở những cây trồng này cần phải 
chọn lọc những cây làm giống và thông qua biện pháp trồng trọt cách ly để tạo ra hạt 
giống sạch virus. Đối với các loài virus gây bệnh ở các cây rau khác thì quá trình lây 
lan thƣờng xảy ra do cơ học hoặc do rệp lá, vì vậy cần có biện pháp vệ sinh đồng 
ruộng và phòng trừ tác nhân truyền bệnh. Ở một số cây rau nhân giống vô tính (nấm 
rơm,...) cần xử dụng phƣơng pháp nuôi cấy đỉnh phân sinh hoặc xử lý nhiệt để giải 
phóng virus. Đối với nấm rơm có thể làm sạch bệnh bằng phƣơng pháp xử lý nhiệt và 
trong thời gian gần đây ngƣời ta đã tạo đƣợc phƣơng pháp miễn dịch trong agar gel. 
Ngoài ra, ở những cây trồng dùng để sản xuất hạt của chúng có thể nhân giống 
vô tính qua nhiều năm, ví dụ nhƣ súp-lơ ngƣời ta cũng cần phải có vật liệu sạch bệnh 
virus ban đầu. Thông qua nuôi cấy mô ngƣời ta tạo đƣợc một vài trăm cây và bằng 
biện pháp thử virus đã thu đƣợc 3.220 cây sạch bệnh. 
7.4.1.5. Cây ăn quả 
Cây ăn quả thƣờng bị virus phá hoại một cách mạnh nhất. Các thể virus gây 
bệnh không những lan truyền khi nhân giống vô tính mà cả khi nhân giống bằng hạt. 
Ngoài ra cây ăn quả thƣờng là cây lâu năm, luôn luôn chịu tác động của các tác nhân 
truyền bệnh vì thế chúng rất dễ bị nhiễm bệnh. Việc chứng minh virus nhiễm ở cây ăn 
quả gặp nhiều khó khăn, hơn nữa thời gian ủ bệnh dài và khả năng chống chịu cao gây 
nhiều khó khăn cho việc làm sạch virus cây ăn quả, vì vậy cần tiến hành công tác 
chống virus gây bệnh ở cây ăn quả một cách liên tục. 
Vì việc xử lý nhiệt đối với các cây thân gỗ và việc nuôi cấy đỉnh phân sinh của 
chúng khó khăn hơn nhiều so với các loài cây thân thảo cho nên từ lâu ngƣời ta đã xử 
dụng phƣơng pháp thử để tìm ra các vật liệu sạch bệnh ban đầu. Quá trình xử lý nhiệt 
đối với cây ăn quả đến nay thƣờng đƣợc tiến hành chủ yếu ở những đoạn cành mà các 
mắt của chúng sẽ đƣợc xử dụng để ghép sau này. Theo tài liệu tổng hợp của Nyland 
và Coheen (1969) về vấn đề xử lý nhiệt ở các cây thân gỗ có thể loại trừ đƣợc bốn loài 
virus ở cây anh đào, một loài virus ở cây mận, bảy loài virus ở cây táo, hai virus ở cây 
nho đất (nho tây), sáu virus ở cây đào và hai virus ở phúc bồn tử. Thành công trong xử 
lý nhiệt ở cây ăn quả không bao giờ đạt đƣợc 100%. Ở mỗi đối tƣợng ít nhất còn lại 
một thậm chí một số loài còn tới bốn virus không bị mất hoạt tính khi xử lý nhiệt. 
Nuôi cấy đỉnh phân sinh ở cây ăn quả tới nay mới chỉ đƣợc sử dụng ở những 
đối tƣợng sau: dâu chua, dâu chua quả đỏ, dâu chua quả đen và cây táo. Thực tiễn cho 
thấy đối với cây ăn quả (cây thân gỗ) việc nuôi cấy đỉnh phân sinh còn gặp khó khăn 
hơn bởi vì khả năng tái sinh của chúng yếu hơn so với cây thân thảo. Các thí nghiệm 
trong những năm sắp tới chắc chắn sẽ nêu ra những kết quả mới. 
7.4.1.6. Cây hoa 
Ở đối tƣợng cây hoa chỉ gặp những cây nhân giống vô tính thƣờng bị bệnh 
virus trong khi bƣớc đầu ngƣời ta chỉ tập trung làm sạch bệnh ở những cây hoa có ý 
nghĩa kinh tế quan trọng (ví dụ: hoa cúc, hoa anh túc, hoa thủy tiên...). Hiện nay, 
ngƣời ta bắt đầu nuôi cấy các loài hoa khác. Xử lý nhiệt kết hợp với nuôi cấy đỉnh 
phân sinh đƣợc sử dụng để làm sạch virus ở hoa anh túc và hoa cúc. 
Việc ứng dụng thực tiễn trong các xí nghiệp chuyên sản xuất hoa đã trở thành 
quen thuộc trong những năm gần đây. Ở Hà lan, có những cơ sở của tổ chức trồng hoa 
chuyên nhận các loài vật liệu để làm sạch virus. Ở Anh, cũng tổ chức một cơ quan 
tƣơng tự nhƣ vậy. Ở Đông Đức (cũ) có xí nghiệp ƣơm cây con ở thành phố Dresden 
cũng nhân các loài hoa nhƣ cúc, hoa anh túc, hoa thủy tiên... để xử lý nhiệt và làm 
sạch virus. 
Các điều kiện để làm sạch virus đối với cây hoa thƣờng đƣợc thực hiện dễ 
dàng, vì thế ở những loài cây trồng này việc làm sạch virus thƣờng có kết quả nhất. Vì 
thế dƣới đây một số biện pháp quan trọng nhƣ xử lý nhiệt, nuôi cấy đỉnh phân sinh và 
xét nghiệm virus đƣợc trình bày trên đối tƣợng cây hoa. 
7.4.2. Kiểm định tính sạch bệnh virus 
Nếu trong qui trình làm sạch virus có thể áp dụng đƣợc kỹ thuật xử lý nhiệt và 
nuôi cấy đỉnh phân sinh thì việc xét nghiệm virus chỉ còn là biện pháp kiểm tra cuối 
cùng của quá trình làm sạch virus, nhƣ vậy sẽ có mâu thuẩn với mục đích làm sạch 
virus nếu ngƣời ta sử dụng 50% cây trong tập đoàn cây trồng bị bệnh làm vật liệu ban 
đầu và coi chúng là những cây có phẩm chất tốt, một mặt thông qua cải tiến phƣơng 
pháp xét nghiệm đƣa độ chính xác của phƣơng pháp lên cao ngƣời ta phải luôn tính để 
số lƣợng virus bảo tồn ở nồng độ tối thiểu mà phƣơng pháp xét nghiệm không chứng 
minh đƣợc. 
Vì vậy, theo kinh nghiệm thực tế cần tiến phải xét nghiệm theo phƣơng thức sau: 
Đƣa vật liệu ban đầu vào xử lý nhiệt trong một thời gian dài để làm sạch những 
virus mẫn cảm nhiệt độ sau đó dùng phƣơng pháp nuôi cấy đỉnh phân sinh sau từ 4-6 
tháng kể từ ngày nuôi cấy mới bắt đầu xét nghiệm thời gian này đủ để cho virus bảo 
tồn trong cây đủ nồng độ cho phép chứng minh đƣợc. Những cơ thể đƣợc xác định là 
sạch bệnh là nguồn vật liệu ban đầu để cung cấp cây mẹ cho sản xuất. Khoảng 5-10% 
số cơ thể này đƣợc tách riêng ra thành tập đoàn nhân mạnh khoẻ (health nucleus 
clone) để các nhà tạo giống cải tiến tính chất theo ý muốn và độ thuần chủng (đồng 
nhất) của giống. Ngƣời ta kiểm tra những cơ thể này bằng tất cả các phƣơng pháp xét 
nghiệm virus hiện có. Với hoa nelken ngƣời ta đã kiểm tra bằng phƣơng pháp huyết 
thanh các loài virus caruation woltle, caruation latent, caruation ringspot... và xét 
nghiệm bằng cây chỉ thị Cheuopodium quinoa và Vaccara pyramydata nhằm loại trừ 
những virus ít sinh sản không có biểu hiện nhận biết đƣợc. Những cây xác minh đƣợc 
là khoẻ đƣợc tiến hành ƣơm cành rồi sau đó đƣa vào xử lý nhiệt, tiếp theo nuôi cấy 
đỉnh sinh trƣởng và cuối cùng kiểm tra bằng xét nghiệm virus. Đó là toàn bộ qui trình 
làm sạch virus khép kín. 
Ngoài phƣơng pháp và quá trình xét nghiệm thì kết quả làm sạch virus phụ 
thuộc nhiều vào trạng thái của cây cần đƣợc xét nghiệm, nghĩa là nồng độ virus có 
trong các bộ phận khác nhau, tuổi khác nhau, mùa khác nhau. Muốn bảo đảm xét 
nghiệm hàng loạt chính xác thì cần phải có nhà nuôi cây. Nhiệt độ ổn định, tƣơng 
quan ánh sáng ổn định và cây xét nghiệm phải cùng độ tuổi nhất định với nồng độ 
virus thích hợp cho xét nghiệm, cho phép thu đƣợc kết quả xét nghiệm chính xác. 
7.4.3. Duy trì tính sạch bệnh virus 
Vấn đề có tầm quan trọng đáng kể và cũng là vấn đề quyết định cuối cùng đối 
với thực tiễn nông nghiệp liên quan tới thời gian duy trì đƣợc cây trồng sạch virus. 
Đối với thực tiễn sản xuất thì cây đƣợc coi là bị bệnh chỉ khi nào năng xuất giảm 
xuống. Hiện nay, trong sản xuất nông nghiệp và trồng cây ăn quả vấn đề này còn chƣa 
đƣợc giải quyết thỏa đáng. Việc sản xuất dòng Elite trong qui trình sản xuất khoai tây 
giống kéo dài nhiều năm, trong khi đó nguy cơ tái nhiễm thông qua yếu tố truyền bệnh 
luôn tồn tại và phụ thuộc vào điều kiện khí hậu. Trong ngành trồng hoa tình hình 
thuận lợi hơn nhiều. Hiện nay ở CHLB Đức với tập đoàn nhân (nucleus clone) của 
hoa cúc và nelken ngƣời ta duy trì đƣợc tính sạch bệnh trong một năm rƣỡi, trong khi 
chỉ cần một năm là có thể thay đƣợc hoàn toàn tập đoàn giống. Vì vậy, vấn đề nêu ra ở 
trên có thể đƣợc trả lời tóm tắt nhƣ sau: khối lƣợng và chất lƣợng vật liệu có sẵn ban 
đầu xác định khả năng sản xuất một vụ không bị giảm năng suất do bệnh virus. 
Giảm năng suất có thể xuất hiện nếu nguồn giống sạch virus bị nhiễm sớm. Đối với 
khoai tây thì nhiễm chủ yếu do các yếu tố truyền bệnh sống ở điều kiện tự nhiên đối 
với cây hoa thì tái nhiễm xảy ra khi đƣa cây giống sạch bệnh vào các xí nghiệp sản 
xuất bị nhiễm sẵn. Có thể nói rằng trong ngành trồng hoa qui trình làm sạch virus 
đƣợc coi nhƣ mô hình phƣơng pháp. Cũng qua đó có thể nhận thấy phƣơng pháp làm 
sạch virus không phải là biện pháp chữa bệnh một lần mà là một quá trình phức tạp 
đối với cây trồng đã bị bệnh từ trƣớc. Ngƣời ta có thể so sánh bệnh virus của thực vật 
nhân giống vô tính nhƣ bệnh xã hội của con ngƣời không thể chữa bằng thuốc men mà 
phải thay đổi cả thói quen sinh hoạt. Ở các xí nghiệp công nghiệp sản xuất cây trồng 
có thể gọi các tiến bộ khoa học kỹ thuật là một loại stress khi mà từ một cây cúc mẹ 
một năm cho 100 cây ƣơm, trƣớc kia chỉ thu đƣợc 15 và một cây ƣơm chỉ cần 11 ngày 
để ra rễ trong khi trƣớc đây cần 21 ngày. Để tạo điều kiện cho các xí nghiệp sản xuất 
công nghiệp cây giống thu đƣợc những thành tích to lớn hơn nữa thì việc đầu tƣ hàng 
năm cho công tác chống bệnh virus trở nên cần thiết. Trong trƣờng hợp nhân giống vô 
tính in vitro thì việc làm sạch virus càng phải đƣợc coi là điều kiện trƣớc tiên. 
CÂU HỎI ÔN TẬP 
1. Nêu tầm quan trọng của phƣơng pháp làm sạch virus thong qua nuôi cấy mô 
2. Trình bày nguyên lý làm sạch virus cho thực vật 
3. So sánh các phƣơng pháp chuẩn đoán bệnh virus ở thực vật 
4. Trình bày kỹ thuật nuôi cấy đỉnh phân sinh 
5. Khái quát các kết quả trong thực tiễn sản xuất của phƣơng pháp tạo giống sạch 
virus nhờ nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng 
 TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1) Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phƣơng Thảo, (2003). 
Giáo trình công nghệ sinh học nông nghiệp. Nhà xuất bản Nông nghiệp 
 2) Lê Văn Hoàng. Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật, Nxb Đà nẵng 
3) Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật 
trong công tác cải tiến giống cây trồng. Nhà xuất bản Nông nghiệp 
4) Nguyễn Văn Uyển, (1996). Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật. NXB 
Nông nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh