Lên men malolactic của Streptococcus mutans và vai trò bảo vệ vi khuẩn khỏi tổn thương oxi hóa

 92 
33(4): 92-96 Tạp chí Sinh học 12-2011 
LÊN MEN MALOLACTIC CủA Streptococcus mutans 
Và VAI TRò BảO Vệ VI KHUẩN KHỏI TổN THƯƠNG OXI Hóa 
NGUYễN THị MAI PHƯƠNG 
Viện Công nghệ sinh học 
 ROBERT E. MARQUIS 
Đại học Rochester, Hoa Kỳ 
Lên men malolactic (malolactic 
fermentation - MLF) do vi khuẩn Oenococcus 
oeni thực hiện đ) đ−ợc nghiên cứu khá chi tiết 
do vai trò quan trọng của nó trong công nghiệp 
sản xuất r−ợu [5]. Đây là quá trình lên men thứ 
cấp sau quá trình lên men r−ợu do nấm men 
thực hiện. Trong quá trình lên men này, axit 
L-malic dicarboxylic đ−ợc chuyển hóa thành 
axit monocarboxylic L-lactic và giải phóng CO2, 
giúp làm tăng h−ơng vị và làm giảm độ axit của 
r−ợu. Sự lên men này còn đ−ợc phát hiện ở 
nhiều chủng vi khuẩn lactic (LAB) khác nh− các 
thành viên của chi Lactobacillus, Leuconostoc, 
và Streptococcus [1-3]. Quá trình decarboxyl 
hóa của L-malic đ−ợc thực hiện nhờ enzim 
malolactic (MLE) với sự có mặt của NAD+ và 
Mn2+ [11]. Sự lên men cũng đi kèm với quá trình 
sinh tổng hợp ATP đ−ợc xúc tác bởi enzim 
F(H+)-ATPase trên màng, vì quá trình lên men 
dẫn đến sự kiềm hóa tế bào chất do L-lactic hình 
thành có độ axit thấp hơn L-malic. Điều này cho 
phép proton đ−ợc vận chuyển từ bên ngoài vào 
tế bào chất thông qua hoạt động của enzim F-
ATPase theo cơ chế synthetase. Kết quả là ATP 
đ−ợc hình thành. Mặt khác, sự sinh tổng hợp 
ATP có thể còn liên quan đến hệ thống vận 
chuyển đối ng−ợc malate/lactate (antiport) cũng 
có sự tham gia của F(H+)-ATPase [9]. Gần đây, 
Sheng và Marquis [10] đ) phát hiện thấy chủng 
Streptococcus mutans UA159 có mang các gene 
m) hoá cho quá trình lên men malolactic trong 
đó có SMu 0121 m) hóa cho MLE có trình tự 
base t−ơng tự nh− trình tự của enzim này ở các 
chủng LAB [1, 4]. Khi nghiên cứu về sinh lý 
của quá trình này, các tác giả đ) phát hiện thấy 
MLF có vai trò làm kiềm hóa mảng bám răng 
(dental plaque), vì vậy làm tăng khả năng chịu 
stress axit của vi khuẩn S. mutans. Bài báo này 
trình bày những phát hiện của chúng tôi về vai 
trò của MLF ở vi khuẩn S. mutans và có thể ở cả 
những chủng vi khuẩn Streptococcus xoang 
miệng khác trong việc bảo vệ tế bào khỏi tổn 
th−ơng oxi hóa gây ra bởi các gốc oxi hoạt động 
(ROS) là O2
-, H2O2 và OH
-
. 
I. PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU 
1. Chủng vi khuẩn và điều kiện nuôi cấy 
Streptococcus mutans UA159 đ−ợc nuôi giữ 
và cấy chuyển hàng tuần trên môi tr−ờng thạch 
chứa bovine heart infusion - BHI agar (Difco 
Laboratories, Detroit, MI). Tế bào đ−ợc nuôi 
cấy trong môi tr−ờng TYM chứa 3% tryptone, 
0,5% cao nấm men, 25 mM glucose và 50 mM 
L-malic để cảm ứng hoạt tính enzim malolactic 
(MLE). 
2. Đo sự lên men L-malic 
Tế bào đ−ợc thu hoạch ở giai đoạn đầu của 
phase ổn định và đ−ợc rửa 2 lần bằng cách ly 
tâm ở tốc độ 6000 g trong 15 phút ở 4oC với 
dung dịch muối có chứa 50 mM KCl và 1 mM 
MgCl2. Tế bào sau đó đ−ợc hòa trở lại với dung 
dịch muối ở mật độ tế bào khoảng 1,1 mg trọng 
l−ợng khô/ml. Axit L-malic ở pH 4,0 đ−ợc thêm 
vào ở nồng độ cuối cùng là 10 mM để bắt đầu 
phản ứng. Sự tiếp nhận L-malic tại mỗi thời 
điểm nhất định đ−ợc đo bằng việc xác định hàm 
l−ợng L-malic đ) đ−ợc chuyển hóa thành axit 
L-lactic sử dụng kít của h)ng Boehringer 
Mannheim (Darmstadt, Germany) có chứa 
enzim L-malic dehydrogenase. Đây là ph−ơng 
pháp đặc hiệu để xác định axit L-malic. Khả 
năng tiếp nhận L-malic của tế bào từ quá trình 
MLF đ−ợc biểu diễn bằng đơn vị nanomole 
L-malic decarboxylated/phút/mg trọng l−ợng 
khô tế bào. 
 93 
3. Tác dụng bảo vệ tế bào 
Các gốc oxi hoạt động (ROS) đ−ợc nghiên 
cứu ở đây bao gồm H2O2 (Sigma), OH
- (tạo thành 
từ phản ứng Fenton của H2O2 kết hợp với ion kim 
loại có khả năng chuyển đổi là Cu2+) và O2
- (tạo 
thành từ hệ thống xanthine-xanthine oxidase). Cụ 
thể, tế bào S. mutans sau khi nuôi cấy trong môi 
tr−ờng TYM đ−ợc thu hoạch, rửa và hòa lại trong 
dung dịch muối có chứa 50 mM KCl và 1 mM 
MgCl2 ở nồng độ 0,4 mg trọng l−ợng khô tế bào. 
L-malic ở pH 4,0 đ−ợc thêm vào dung dịch tế bào 
để đạt nồng độ cuối cùng là 30 mM. Sau đó, 
H2O2, tổ hợp chất H2O2/CuCl2 (để tạo OH
-) hay tổ 
hợp chất xanthine/xanthine oxidase (để tạo O2
-) 
đ−ợc tiếp tục thêm vào. ở những thời điểm nhất 
định, 100 àL mẫu đ−ợc lấy ra, pha lo)ng 10 lần 
liên tiếp với dung dịch peptone 1% (Difco 
Laboratories, Detroit, MI) ở pH 7,0 và đ−ợc cấy 
trải trên đĩa thạch BHI. Các đĩa này đ−ợc ủ trong 
tủ ấm 37oC trong vòng 48 giờ cho đến khi khuẩn 
lạc hình thành rõ rệt, có thể đếm đ−ợc bằng mắt 
th−ờng [8]. 
4. Xác định hàm l−ợng ATP có trong tế bào 
chất 
Hàm l−ợng ATP trong tế bào chất của 
S. mutans đ−ợc xác định theo ph−ơng pháp đo 
ATP bằng huỳnh quang (bioluminescence) đ) 
đ−ợc Sheng & Marquis mô tả (2006). ATP đ−ợc 
chiết ra từ tế bào bằng đệm Tris-HCl 20 mM 
nóng có chứa EDTA 2 mM, pH 7,75. Hàm 
l−ợng ATP trong dịch chiết sau đó đ−ợc xác 
định sử dụng kit Luciferase/Luciferin của h)ng 
Promega (Madison, WI) trên máy đo huỳnh 
quang Luminometer Turner Designs 
(Sunnyvale, CA), Model DT-20/20. 
II. KếT QUả Và THảO LUậN 
1. MLF và khả năng tiếp nhận L-malic ở 
vi khuẩn S. mutans 
Hệ thống lên men L-malolactic mới đ−ợc 
phát hiện và nghiên cứu ở S. mutans rất gần đây 
[10]. Hệ thống này đ−ợc xem là có vai trò bảo 
vệ tế bào S. mutans khỏi tổn th−ơng do stress 
axit gây ra. MLF đ−ợc bắt đầu bằng việc tiếp 
nhận L-malic nhờ enzim permease nằm trên 
màng (Smu 0125) và sau đó cơ chất này đ−ợc 
chuyển hóa thành axit L-lactic và CO2 nhờ MLE 
nằm trong tế bào chất. ở các chủng vi khuẩn có 
MLF đ) biết nh− LAB, MLF xảy ra mạnh tại 
các giá trị pH thấp hơn 3,0 [5, 11]. Để tìm hiểu 
khả năng tiếp nhận L-malic ở S. mutans, chúng 
tôi đ) tiến hành xác định khả năng đồng hóa 
L-malic tại các giá trị pH khác nhau để tìm ra 
điều kiện pH tối thích cho quá trình lên men này 
ở S. mutans. Kết quả trình bày ở hình 1 cho 
thấy, MLF ở S. mutans có thể diễn ra ở các giá 
trị pH khác nhau từ 3,0 đến 7,0. Tuy nhiên, giá 
trị pH 4,0 là thích hợp nhất cho hoạt động MLF 
của S. mutans, đồng nghĩa với việc vi khuẩn có 
khả năng tiếp nhận L-malic tốt nhất. MLF tại 
pH 4,0 đạt tới 10,2 mmole/phút/mg trọng l−ợng 
khô (TLK) tế bào so với các giá trị 3,2 ở pH 3,0; 
7,8 ở pH 5,0; 4,0 ở pH 6,0 và 1,6 ở pH 7,0. 
Động học của quá trình tiếp nhận L-malic tại pH 
4,0 cũng đ) đ−ợc xác định (hình 2) và cho thấy, 
tại giá trị pH 4,0, quá trình tiếp nhận đạt mức độ 
tuyến tính trong khoảng thời gian 60 phút đầu 
tiên và sau đó tiến dần đến giá trị b)o hòa. 
Những kết quả thu đ−ợc ở đây là cơ sở để chúng 
tôi lựa chọn những điều kiện thích hợp cho các 
nghiên cứu về MLF tiếp theo. 
3.0 3.5 4.0 5.0 6.0 7.0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Hình 1. MLF của S. mutans 
tại các giá trị pH khác nhau 
0 40 80 120 160 200
0
1
2
3
Hình 2. Động học của quá trình tiếp nhận 
L-malic của S. mutans tại giá trị pH 4,0 
m
m
ol
e 
L
-m
al
at
e 
đ
−ợ
c 
ti
ếp
 n
h
ận
/g
iờ
/m
gT
L
K
m
m
ol
e 
L
-m
al
at
e 
đ
−ợ
c 
ti
ếp
 n
h
ận
/g
iờ
/m
gT
L
K
Phút 
pH 
3,0 , , 5,0 , , 
 94 
Hình 3. LMF bảo vệ S. mutans khỏi tác dụng gây chết của các gốc tự do. A. H2O2; B. OH
-; C. O2
- 
2. MLF bảo vệ S. mutans khỏi tác dụng gây 
chết của các gốc tự do 
MLF đ−ợc phát hiện có vai trò bảo vệ 
S. mutans khỏi tổn th−ơng do axit [10], nh−ng 
cho đến nay ch−a có công bố nào đề cập đến vai 
trò của nó trong các quá trình sinh lý khác của 
tế bào trong đó có stress oxi hóa, cùng với stress 
axit là hai stress rất phổ biến trong mảng bám 
răng. 
Các vi khuẩn xoang miệng trong đó có 
S. mutans trên mảng bám răng phải th−ờng 
xuyên tiếp xúc với các gốc ROS [7]. Các gốc 
ROS này có khả năng tấn công các đại phân tử 
sinh học của tế bào nh− protein, ADN và lipid, 
gây chết tế bào [6]. Vậy hệ thống MLF có vai 
trò nh− thế nào trong việc bảo vệ tế bào khỏi tác 
dụng gây tổn th−ơng oxi hóa do các ROS gây 
ra? Để tìm hiểu vấn đề này, chúng tôi đ) tiến 
hành nghiên cứu tác dụng gây chết tế bào 
S. mutans khi có mặt của các gốc tự do và 
L-malic (cơ chất của quá trình lên men MLF). 
Kết quả thu đ−ợc ở hình 3A cho thấy rằng, khi 
không có mặt của L-malic, H2O2 có tác dụng 
gây chết mạnh tế bào với giá trị D (thời gian gây 
chết 90% quần thể tế bào) là khoảng 15 phút. 
C 
A 
Đối chứng 
58 mM H2O2 
58 mM H2O2+ 30 mM L-malic 
0 10 20 30 40 50 60 70 
-5,5 
-4,5 
-3,5 
-2,5 
-1,5 
-0,5 
0,5 
Phút 
L
og
 N
/N
o 
Đối chứng 
1,25 mM xanthine + 50 mU/ml xanthine oxidase (XO) 
30 mM L-malic +1,25 mM xanthine + 50 mU/ml XO 
1,25 mM xanthine 
50 mU/ml XO 
B Đối chứng 
49 mM H2O2 + 29 mM CuCl2 
30 mM L-malic +49 mM H2O2 + 29 mM CuCl2 
49 mM H2O2 
29 mM CuCl2 
0 10 20 30 40 50 60 70 
-10 
-8 
-6 
-4 
-2 
0 
Phút 
L
og
 N
/N
o 
-6,5 
-5,5 
-4,5 
-3,5 
-2,5 
-1,5 
-0,5 
0,5 
Phút 
L
og
 N
/N
o 
0 10 20 30 40 50 60 70 
 95 
Tuy nhiên, khi có mặt của L-malic và quá trình 
MLF diễn ra, giá trị D tăng lên đến 27 phút, 
đồng nghĩa với việc tế bào đ) đ−ợc bảo vệ một 
phần khỏi tác dụng của ROS này. Một bức tranh 
t−ơng tự cũng đ−ợc tìm thấy khi tế bào đ−ợc xử 
lý với OH- (tạo ra từ phản ứng của H2O2 và 
CuCl2) và O2
-
 (tạo ra từ phản ứng của xanthine và 
xanthine oxidase). Đặc biệt, trong tr−ờng hợp có 
mặt của OH-, tác dụng bảo vệ của MLF là rất rõ 
rệt nhất với các giá trị D lần l−ợt đạt 10 và 26 
phút (hình 3B). T−ơng tự nh− vậy, tác dụng bảo 
vệ của MLF là khá rõ ràng trong tr−ờng hợp của 
O2
- với giá trị D = 9 và 13 phút (hình 3C). Nh− 
vậy có thể thấy rằng, MLF có tác dụng bảo vệ tế 
bào khỏi tác dụng tấn công của các gốc ROS. 
Đây là một phát hiện mới về mối liên quan giữa 
MLF và stress oxi hóa ở vi khuẩn nói chung và 
ở S. mutans nói riêng. 
3. Sinh tổng hợp ATP trong quá trình MLF 
Hàm l−ợng ATP trong tế bào chất của 
S. mutans trong quá trình MLF tại pH 4,0 đ) 
đ−ợc xác định để tìm hiểu mối liên quan giữa 
tác dụng bảo vệ tế bào khỏi tổn th−ơng oxi hóa 
do ROS của MLF và quá trình sinh tổng hợp 
ATP. Kết quả trình bày ở hình 4 cho thấy, hàm 
l−ợng ATP nội sinh đ) tăng lên rõ rệt trong quá 
trình lên men này so với đối chứng. Tế bào sinh 
tổng hợp ATP mạnh trong khoảng 10 phút đầu 
của quá trình tiếp nhận L-malic và duy trì hàm 
l−ợng ATP cao trong suốt thời gian 60 phút thí 
nghiệm. Trong khi đó, hàm l−ợng ATP ở mẫu 
đối chứng lại bị giảm dần do đ−ợc sử dụng vào 
các hoạt động sống sinh lý của tế bào khi môi 
tr−ờng bị đói cơ chất và gần nh− biến mất sau 60 
phút. Phát hiện này cũng đ) đ−ợc Sheng và 
Marquis [10] mô tả khi tế bào đ−ợc xử lý với 
stress axit trong điều kiện có mặt của L-malic. 
Nh− vậy, các số liệu thu đ−ợc trong nghiên cứu 
này đ) cho thấy sự tăng c−ờng sinh tổng hợp 
ATP trong MLF có vai trò bảo vệ tổn th−ơng oxi 
hóa ở vi khuẩn S. mutans và có thể là một thành 
phần quan trọng của đáp ứng với tổn th−ơng oxi 
hóa ở vi khuẩn này. 
Hình 4. Hàm l−ợng ATP trong quá trình MLF tại pH 4,0 
III. KếT LUậN 
Lên men malolactic ở vi khuẩn S. mutans có 
vai trò trong việc bảo vệ vi khuẩn khỏi tác dụng 
gây chết do các gốc oxi hoạt động gây ra thông 
qua việc tăng c−ờng sinh tổng hợp ATP trong 
quá trình lên men này. 
TàI LIệU THAM KHảO 
1. Ansanay V., Dequin S., Blondin B. & 
Barre P., 1993: Cloning, sequence and 
expression of the gene encoding the 
malolactic enzyme from Lactococcus lactis. 
FEBS Lett, 332: 74-80. 
2. Arthurs C. E. & Lloyd D., 1999: Kinetics, 
steroespecificity, and expression of the 
malolactic enzyme. Appl. Environ. 
Microbiol, 65: 3360-3363. 
3. Battermann G. & Radler F., 1991: A 
comparative study of malolactic enzyme and 
malic enzyme of different lactic acid 
bacteria. Can. J. Microbiol, 37: 211-217. 
4. Denayrolles M., Aigle M. and Lonvaud-
Funel A., 1994: Cloning and sequence 
analysis of the gene encoding Lactobacillus 
lactis malolactic enzyme: relationships with 
malic enzymes. FEMS Microbiol. Lett, 116: 
79-86. 
Đối chứng 
25 mM L- malic 
nm
ol
e 
A
T
P
/ 
m
g 
T
L
K
0 10 20 30 40 50 60 70 
0,0 
0,5 
1,0 
1,5 
2,0 
2,5 
3,0 
3,5 
Phút 
 96 
5. Herrero M., García L. A. and Díaz M., 
2003: Malolactic bioconversion using a 
Oenococcusoeni strain for cider production: 
effect of yeast extract supplementation. J. 
Ind. Microbiol. Biotechnol, 30: 699-704. 
6. Imlay J. A., 2003: Pathways of oxidative 
damage. Annu. Rev. Microbiol, 57: 395-
418. 
7. Marquis R. E., 2004: Applied and 
ecological aspects of oxidative-stress 
damage to bacterial spores and to oral 
microbes. Sci. Prog, 87: 153-177. 
8. Phan T. N., Reidmiller J. S. and Marquis 
R. E., 2000: Sensitization of Actinomyces 
naeslundii and Streptococcus sanguis 
biofilms and suspensons to acid damage 
by fluoride and other weak acids. 
Arch. Microbiol, 174: 248-255. 
9. Poolman B., Molenaar D., Smid E. D., 
Ubbink T., Abee T., Renault P. P. & 
Konings W. N., 1991: Malolactic 
fermentation: electrogenic malate uptake 
and malate/lactate antiport generate 
metabolic energy. J. Bacteriol, 173: 6030-
6037. 
10. Sheng J. & Marquis R. E., 2006: 
Enhanced acid resistance of oral 
streptococci at lethal pH values associated 
with acid-tolerant catabolism and with ATP 
synthase activity. FEMS Microbiol. Lett, 
262: 93-98. 
11. Strasser de Saad A. M., Pesce de Ruiz 
Holgado A. A. and Oliver G., 1988: 
Malolactic enzyme in Lactobacillus 
murinus. Biochimie, 70: 357-365. 
MALOLACTIC FERMENTATION BY Streptoccocus mutans 
AND PROTECTION AGAINST OXIDATIVE DAMAGE 
NGUYEN THI MAI PHUONG, ROBERT E. MARQUIS 
SUMMARY 
Streptococcus mutans is the primary etiological agent of human dental caries. The extraordinary ability of S. 
mutans to adapt and survive the environmental stresses in human mouth, particularly oxidative stress even 
though it does not have catalase, a key protective enzyme against oxidative damage, make it be an attractive 
subject for dental research. In the oral cavity, S. mutans is routinely exposed to reactive oxygen species (ROS) 
such as hydrogen peroxide (H2O2), superoxide (O2
•−) and hydroxyl radical (OH•) generated by aerobic 
respiration, by H2O2 net secretors in plaque dental such as Streptococcus sanguis and S. gordonii, or by 
exposure to H2O2-containing dental care products. Alkali production by oral streptococci is considered 
important for dental plaque ecology and caries moderation. Recently, malolactic fermentation (MLF) was 
identified as a major system for alkali production by oral streptococci, including Streptococcus mutans. 
Malolactic fermentation is inducible by L-malate, involving decarboxylation of L-malate to yield L-lactic acid 
and concomitant reduction in acidity. Our major objectives in the work described in this paper were to further 
define the physiology of MLF of S. mutans and its roles in protection against oxidative stress damage. For the 
first time, L-malic, was found to enhance the protection of S. mutans against oxidative damage by reactive 
oxygen species including O2
•− generated by xanthine-xanthine oxidase system; H2O2 and OH
• produced via 
Fenton reaction between H2O2 and metal cations at pH values of 4.0. Protection involved L-malic uptake with 
the significantly enhanced production of ATP from malate fermentation, to maintain ATP pool levels for 
physiological activities in the cells. In general, oxidative protection by malolactic fermentation against ROS 
damage involving catabolism of L-malic and ATP production is likely to be an important virulent trait of S. 
mutans. 
Key words: Streptococcus mutans, malolactic fermentation (MLF), oxidative damage. 
Ngày nhận bài: 4-5-2011