Phát hiện và định lượng Hepatitis B virus DNA bằng kỹ thuật Real–time polymerase chain reaction với đường chuẩn tự dựng

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 
Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 182 
PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG HEPATITIS B VIRUS DNA 
BẰNG KỸ THUẬT REAL–TIME POLYMERASE CHAIN REACTION 
VỚI ĐƯỜNG CHUẨN TỰ DỰNG 
Nguyễn Trần Minh Thắng*, Trịnh Thùy Dương*, Nguyễn Kim Thạch*, Đỗ Như Hiền* 
TÓM TẮT 
Đặt vấn đề: HBV là một loại Hepadnavirus gây ra bệnh viêm gan cấp hoặc mãn. Người nhiễm virus viêm 
gan B mãn thường kết hợp với những bệnh cảnh lâm sàng khác nhau, từ đó gây ra cái chết của khoảng 500,000 – 
700,000 người mỗi năm. Vì vậy, kỹ thuật real-time PCR ra đời để định lượng HBV-DNA chính xác hơn, nhanh 
hơn, hiệu suất cao hơn và đã được áp dụng ở nhiều nơi trong cả nước. 
Mục tiêu nghiên cứu: Nghiên cứu thiết lập kỹ thuật real-time PCR với đường chuẩn tự dựng để định 
lượng HBV-DNA trên vùng pre-S 89bp ở các mẫu máu của bệnh nhân đến xét nghiệm viêm gan B. 
Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả được tiến hành trên 46 bệnh nhân bị nhiễm virus viêm gan 
B. Tất cả bệnh nhân được định lượng HBV-DNA bằng kỹ thuật real-time PCR với đường chuẩn tự dựng của bộ 
môn Hóa Sinh – Sinh Học Phân Tử Trường ĐHYKPNT. Kết quả được so sánh với kết quả real-time PCR sử 
dụng đường chuẩn thương mại. Sự tương đồng giữa hai kỹ thuật được chứng minh qua test Wilcoxon, test 
Spearman và biểu đồ Bland và Altman. 
Kết quả nghiên cứu: Qua khảo sát, chúng tôi đã tối ưu hóa được điều kiện cho kỹ thuật real-time PCR với 
nhiệt độ bắt cặp mồi 600C, nồng độ mồi 400 nM, nồng độ mẫu dò Taqman 100 nM và độ nhạy của phản ứng là 
100 copies/ml. Kiểm tra đường chuẩn đã được thiết lập có R2 ≥ 0,99 và E% là 100% và hệ số góc là -3,58 là đạt 
chuẩn với cặp mồi được lựa chọn đặc hiệu cho virus viêm gan B. Từ đó, chúng tôi đã phát hiện và định lượng 
được HBV-DNA ở 34 trong 46 trường hợp. So sánh với kết quả real-time PCR sử dụng đường chuẩn thương 
mại, kết quả real-time PCR sử dụng đường chuẩn tự dựng cho thấy có sự tương đồng. 
Kết luận: Qua nghiên cứu này, chúng tôi đã thiết lập được kỹ thuật Real-time PCR dùng để định lượng 
HBV- DNA với đường chuẩn tự dựng của bộ môn Hóa Sinh – Sinh Học Phân Tử trường ĐHYKPNT. 
Từ khóa: viêm gan, HBV-DNA, real-time PCR. 
ABSTRACT 
DETECTION AND QUANTITY Hepatitis B VIRUS DNA BY REAL-TIME Polymerase Chain Reaction 
WITH SELF-DEVELOPMENT STANDARDS 
Nguyen Tran Minh Thang, Trinh Thuy Duong, Nguyen Kim Thach, Do Nhu Hien 
 * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 2 - 2011: 182 - 189 
Introduction: HBV is a Hepadnavirus causing acute or chronic hepatitis. People infected with chronic 
hepatitis B virus are often associated with many different clinical situations, thereby it has caused the death of 
about 500.000 to 700.000 patients every year. Thus, real-time PCR technique was born to quantify HBV-DNA 
more accurately, more efficiently and faster and has been applied in many places in the country. 
Research Objective: the technical set up real-time PCR study with the self building standard curve to 
quantify HBV-DNA in the pre-S region 89bp in the patient's blood sample tested for hepatitis B. 
* Bộ môn Sinh Hóa - Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 
Tác giả liên lạc: BS. Nguyễn Trần Minh Thắng ĐT 0934.014.937 
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Nghiên cứu Y học
Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 183 
Research Methodology: The descriptive study was conducted on 46 patients infected with hepatitis B. All 
patients were quantified HBV-DNA by real-time PCR technique with the self building standard curve of 
Biochemistry - Molecular Biology department of Phạm Ngọc Thạch University of Medicine. Results were 
compared with real-time PCR results using standard curve commercial. The similarities between the two 
techniques will be demonstrated by Wilcoxon test, Spearman test and Bland and Altman graph. 
Research results: Through the survey, we have optimized the conditions for real-time PCR technique with 
primer pairs temperature at 60C, 400 nM primer concentration, concentration of 100 nM Taqman sample probe 
and the sensitivity of reaction was 100 copies / ml. Testing the baseline was set up with R2 ≥ 0.99 and E% is 
100% and the angular coefficient is -3.58 with a standard primer pairs were selected specific for hepatitis B. Since 
then, we have detected and quantified HBV-DNA in 34 out of 46 cases. Compared with real-time PCR results 
using standard curve commercial, real-time PCR results using self building standard curve shows the 
similarities. 
Conclusion: In this study, we have established real-time PCR technique using to quantify HBV-DNA with 
self building standard curve of Biochemistry - Molecular Biology department of Phạm Ngọc Thạch University of 
Medicine. 
Key words: hepatitis, HBV-DNA, real-time PCR. 
ĐẶT VẤN ĐỀ 
Nhiễm virus viêm gan B là một vấn đề đang 
rất được quan tâm ở nhiều quốc gia trên thế giới 
hiện nay. Nhiễm virus viêm gan B là một trong 
những nguyên nhân làm tăng tỉ lệ mắc bệnh và 
tăng tỉ lệ tử vong toàn cầu(1,15). 
HBV là một loại Hepadnavirus gây ra bệnh 
viêm gan cấp hoặc mãn. Mặc dù việc sử dụng 
vắc xin đã hiện hữu trong hai thập kỷ qua nhưng 
vẫn có khoảng 360 triệu người trên thế giới bị 
nhiễm virus viêm gan B mãn tính(15). Người 
nhiễm virus viêm gan B mãn thường kết hợp với 
những bệnh cảnh lâm sàng khác nhau, từ người 
lành mang mầm bệnh không triệu chứng đến xơ 
gan và ung thư tế bào gan. Trong đó, xơ gan và 
ung thư tế bào gan là các nguyên nhân chính 
gây ra cái chết của 500,000 – 700,000 người mỗi 
năm(15). 
Việc chẩn đoán và theo dõi lâm sàng của 
nhiễm virus viêm gan B chủ yếu dựa trên sự 
phát hiện kháng nguyên (HBsAg, HBeAg), 
kháng thể (anti HBs, anti HBc và anti HBe) 
bằng kỹ thuật ELISA và chất liệu di truyền của 
virus (HBV – DNA) dựa trên kỹ thuật sinh học 
phân tử. Trong đó, xét nghiệm ELISA vẫn là 
một trong các phương pháp chính để phát hiện 
người nhiễm virus viêm gan B. Tuy nhiên, kết 
quả của ELISA không phản ánh được chính 
xác lượng virus trong huyết thanh hay hoạt 
động của virus viêm gan B cũng như hiệu quả 
của điều trị thuốc kháng virus(16). Bên cạnh đó, 
khoảng mười năm gần đây, xét nghiệm PCR(14), 
các phương pháp lai bắt RNA:DNA(11), phương 
pháp khuếch đại tín hiệu bởi bDNA(7,11) ... là 
các xét nghiệm có độ nhạy và độ đặc hiệu cao 
trong việc phát hiện HBV – DNA cũng được sử 
dụng rộng rãi. Mặc dù vậy trên thực tế, các 
phương pháp này bị giới hạn vì khả năng dễ 
lây nhiễm chéo của mẫu thử trong quá trình 
thao tác kỹ thuật và tốn nhiều thời gian trong 
giai đoạn điện di sau thí nghiệm nên không 
thích hợp để thực hiện thường qui trong thực 
chẩn đoán cận lâm sàng(8,13,14). Một phương 
pháp chính xác hơn, nhanh hơn và cho hiệu 
suất cao hơn để định lượng HBV – DNA và 
định genotype của virus viêm gan B, đó là 
Real-time PCR(12). Hiện nay, đây là phương 
pháp hữu dụng trong việc theo dõi hiệu quả 
của điều trị, phát hiện các đột biến đề kháng 
thuốc và tái phát sau khi ngưng điều trị. 
Mục đích của nghiên cứu này là bước đầu 
thiết lập phương pháp định lượng HBV – DNA 
trên nền tảng ứng dụng kỹ thuật Real-time PCR 
phát hiện vùng pre-S 89bp(6,8) với đường chuẩn tự 
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 
Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 184 
dựng và sử dụng các đoạn dò huỳnh quang 
Taqman. 
Chúng tôi hi vọng từ nghiên cứu này có 
thể đưa ra thêm một phương pháp xét nghiệm 
HBV-DNA đáp ứng về chất lượng và giá 
thành hợp lý, giúp phát hiện và theo dõi kết 
quả điều trị ở những bệnh nhân bị viêm gan 
B. Bên cạnh đó, còn có thể sử dụng hóa chất 
của các hãng khác nhau. 
ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP 
NGHIÊN CỨU 
Thiết kế nghiên cứu 
Mô tả các trường hợp bệnh. 
Đối tượng nghiên cứu 
Tất cả các bệnh nhân đến xét nghiệm viêm 
gan B tại BVĐHYD cơ sở 2 có HBsAg dương 
tính và HBeAg dương tính trong khoảng thời 
gian từ 30/08/2009 đến 30/12/2009. 
Loại trừ những bệnh nhân bị viêm gan B mà 
HBsAg âm tính hay HBeAg âm tính hay cả hai 
đều âm tính và những bệnh nhân không đồng ý 
tham gia nghiên cứu. 
Các bước tiến hành 
Lấy máu 
Lấy 4 ml máu và cho vào 2 tube chống 
đông bằng EDTA, mỗi tube 2 ml máu. 1 tube 
lưu giữ tại BVĐHYD cơ sở 2 để làm xét 
nghiệm, 1 tube gửi về bộ môn Hóa Sinh – Sinh 
học Phân Tử trường ĐHYKPNT. Tại phòng 
thí nghiệm ở bộ môn, các mẫu máu sẽ được ly 
tâm tách huyết thanh lưu trữ -20oC. 
Ly trích DNA 
Được thực hiện theo quy trình của bộ High 
Pure PCR Template Preparation Kit (Roche). 
Xây dựng quy trình kỹ thuật Real-time PCR 
Trình tự của cặp mồi 
Mồi HBV dùng để khuếch đại đoạn pre-S 
của virus viêm gan B. Sản phẩm khuếch đại có 
kích thước 89bp, từ vị trí nucleotide 730 – 819. 
Đoạn mồi được cung cấp bởi nhà sản xuất IDT 
(Intergrated DNA Technologies, USA) do bộ 
môn Hóa Sinh – Sinh Học Phân Tử trường 
ĐHYKPNT xây dựng. 
Tối ưu hóa các điều kiện của phản ứng Real-time 
PCR 
Phản ứng Real-time PCR là một phản ứng 
nhạy và cho kết quả định lượng rất chính xác. 
Tuy nhiên, cũng như phản ứng PCR thông 
thường, Real-time PCR có thể bị ức chế bởi một 
số thành phần tồn tại ngay trong chính phản 
ứng như hàm lượng bản mẫu, nhiệt độ bắt cặp 
của mồi, nồng độ của mẫu dò Chính vì vậy, 
chúng tôi tiến hành khảo sát một số điều kiện 
cần thiết cho phản ứng Real-time PCR nhằm tạo 
ra phản ứng Real-time PCR với hiệu quả tối ưu 
nhất, bao gồm: Nhiệt độ bắt cặp của mồi, Khảo 
sát nồng độ mồi, Khảo sát nồng độ mẫu dò 
Taqman. 
Độ lập lại của phản ứng Real-time PCR 
Đây cũng là một yếu tố quan trọng. Trên 
cùng một mẫu, kết quả thu nhận có thể khác 
nhau giữa các lần thí nghiệm cũng như giữa các 
phòng thí nghiệm. Khả năng gây ra sự khác biệt 
này có thể là do thao tác của người thực hiện, sự 
biến động của các thành phần hóa chất trong 
phản ứng Real-time PCR(4), Để đánh giá độ 
lập lại của phản ứng Real-time PCR, chúng tôi 
tiến hành khảo sát độ lập lại của phản ứng trong 
cùng một lần thí nghiệm và giữa các lần thí 
nghiệm(10). 
Đường chuẩn 
Đường chuẩn là một khái niệm rất quan 
trọng và chuyên biệt cho phản ứng Real-time 
PCR. Thông qua đường chuẩn giúp chúng ta có 
thể xác định một cách chính xác hàm lượng acid 
nucleic trong mẫu ta cần quan tâm. Ngoài ra, 
đường chuẩn cũng giúp chúng ta đánh giá liệu 
các điều kiện của phản ứng Real-time PCR mà 
chúng ta chọn là tối ưu hóa hay chưa. Một phản 
ứng Real-time PCR tối ưu phải là phản ứng cho 
E% từ 90-105% và R2 phải đạt ≥ 0,99. Ngoài ra 
tiêu chuẩn tiên quyết một đường chuẩn đạt yêu 
cầu, hệ số góc của đường chuẩn phải đạt từ -3,32 
đến -3,8(5). Trong quá trình làm nghiên cứu này, 
chúng tôi đã tiến hành kiểm tra so sánh với 
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Nghiên cứu Y học
Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 185 
đường chuẩn của công ty Khoa Thương – Việt 
Nam. Chúng tôi dùng một nồng độ là 3 x 102 
trong bộ chuẩn thương mại của công ty Khoa 
Thương Việt Nam để kiểm tra chất lượng đường 
chuẩn. Tiến hành định lượng cùng đường 
chuẩn, phản ứng được lập lại 3 lần. 
Độ nhạy của phản ứng 
Độ nhạy được xác định trên mẫu huyết 
thanh ở người nhiễm virus viêm gan B với nồng 
độ là 4,5 × 107 copies/ml. 
Tiến hành quy trình Real-time PCR 
Phản ứng Real-time PCR của các mẫu bệnh 
phẩm luôn chạy tiến hành cùng một lúc với 
đường chuẩn (mẫu chứng dương) và một mẫu 
nước (mẫu chứng âm). 
Phân tích số liệu 
Số liệu đem đi phân tích với các test chỉ lấy 
từ 33 mẫu phát hiện và định lượng được với cả 
hai kỹ thuật của bộ môn và bệnh viện. Dữ liệu 
được phân tích và mô tả bằng test Wilcoxon(9), 
test phi tham số Spearman(9) và biểu đồ Bland và 
Altman(2,3). Tất cả dữ liệu thống kê sẽ được thực 
hiện bởi phần mềm SPSS 17,0 và Medcalc 
11,3,0,0. 
KẾT QUẢ 
Từ 30/08/2009 đến 30/12/2009, có 46 bệnh 
nhân đến xét nghiệm viêm gan B thỏa tiêu 
chuẩn chọn mẫu được đưa vào nghiên cứu. 
Chúng tôi đã phát hiện và định lượng được 34 
trường hợp có mang virus viêm gan B trong cơ 
thể, 12 trường hợp còn lại có kết quả âm tính. 
Nhiệt độ bắt cặp của mồi 
Sau khi khảo sát các phổ nhiệt độ từ 59 – 
61oC, chúng tôi nhận thấy 60oC là nhiệt độ bắt 
cặp thích hợp nhất. 
Hình 1: Nhiệt độ bắt cặp của mồi 
Khảo sát nồng độ mồi 
Tại nồng độ mồi là 400 nM thì E% là 100,0% 
và R2 ≥ 0,99. Vậy 400 nM là nồng độ mồi tối ưu 
cho phản ứng của chúng tôi. 
Hình 2: Khảo sát nồng độ mồi 
Khảo sát nồng độ mẫu dò Taqman 
200 nM là nồng độ mẫu dò tối ưu với E% là 
100,0% và R2 ≥ 0,99. 
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 
Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 186 
Hình 3: Khảo sát nồng độ mẫu dò 
Độ lặp lại của phản ứng Real-time PCR: 
Độ lập lại trong một phản ứng (intraassay) 
Trị số trung bình của hai nồng độ pha loãng 
10-1 và 10-3 lần lượt là 18,14 và 27,08. 
Hình 4: Đường cong khuếch đại thể hiện độ lập lại 
trong một phản ứng 
Độ lập lại giữa các lần thí nghiệm 
(interassay) 
Kết quả trị số trung bình của hai nồng độ 
pha loãng 10-1 và 10-3 lần lượt 18,38 và 26,61. 
Hình 5: Đường cong khuếch đại thể hiện độ lập lại 
giữa các lần thí nghiệm 
Đường chuẩn 
Kết quả giá trị virus trung bình sau 3 lần thử 
nghiệm là 2,73 × 102 copies/ml, khác biệt không 
đáng kể so với giá trị lý thuyết là 0,27 × 102 
copies/ml. đường chuẩn mà chúng tôi xây dựng 
được có R2 là 0,999 và E% là 100% và hệ số góc là 
-3,58. 
Hình 6: Đường chuẩn 
Độ nhạy của phản ứng 
Độ nhạy của phản ứng Real-time PCR là 100 
copies/ml. 
Hình 7: Kết quả khảo sát độ nhạy của phản ứng 
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Nghiên cứu Y học
Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 187 
BÀN LUẬN 
Phân tích kỹ thuật 
Nhiệt độ bắt cặp của mồi 
Với một phổ nhiệt độ từ 59 – 61oC, chúng tôi 
nhận thấy chu kỳ ngưỡng của sản phẩm khuếch 
đại ở tất cả các nhiệt độ khảo sát không có sự 
khác biệt đáng kể. Tuy nhiên, tại nhiệt độ 60oC 
sản phẩm khuếch đại có tín hiệu huỳnh quang 
cao hơn so với tín hiệu huỳnh quang của sản 
phẩm khuếch đại tại các nhiệt độ khác. Vì vậy, 
chúng tôi chọn nhiệt độ 60oC là nhiệt độ bắt cặp 
thích hợp nhất. Kết quả này cũng phù hợp với 
nghiên cứu trước đó(10,13). 
Khảo sát nồng độ mồi 
Kết quả cho thấy tại nồng độ mồi là 400 nM 
thì E% và R2 nằm trong giới hạn tối ưu của phản 
ứng. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với nghiên 
cứu trước đó(10). Như vậy 400 nM là nồng độ 
mồi tối ưu. 
Khảo sát nồng độ mẫu dò Taqman 
Chúng tôi nhận thấy với các nồng độ mẫu 
dò khác nhau đều cho sản phẩm khuếch đại với 
chu kỳ ngưỡng tương tự nhau, nhưng với nồng 
độ mẫu dò là 200 nM thì với E% là 100,0% và R2 
≥ 0,99. Như vậy, 200 nM là nồng độ mẫu dò tối 
ưu cho phản ứng Real-time PCR. 
Độ lặp lại của phản ứng Real-time PCR 
Khoảng biến thiên của giá trị trung bình 
không quá 1 Ct, chứng tỏ phản ứng Real-time 
PCR của chúng tôi có tính lập lại cao. 
Đường chuẩn 
Việc sử dụng biological standard để tạo 
đường chuẩn có các lợi điểm so với dùng gam 
đường chuẩn thương mai trên thị trường: 
- Rẻ tiền, sản xuất được số lượng lớn. 
- Dễ lưu trữ, dễ chuẩn bị. 
- Chủ động được các khoảng cách về nồng 
độ, không bị giới hạn. 
- Có thể sử dụng hóa chất của các hãng khác 
nhau. 
Ở nghiên cứu này, đường chuẩn mà chúng 
tôi xây dựng được có R2 là 0,999 và E% là 100% 
và hệ số gốc là -3,58. 
Độ nhạy của phản ứng 
Độ nhạy của phản ứng Real-time PCR là 
100 copies/ml, vì tại đó phản ứng cho tín hiệu 
tốt còn ở nồng độ 50 copies/ml tín hiệu thấp 
và 10 copies/ml, phản ứng không có tín hiệu 
được ghi nhận. 
Chất lượng của xét nghiệm 
Test Wilcoxon cho thấy không có sự khác 
biệt về thống kê giữa kết quả của hai kỹ thuật. 
Bên cạnh đó, test phi tham số Spearman cho 
thấy có mối tương quan giữa kỹ thuật Real-time 
PCR của bộ môn Hóa Sinh – Sinh Học Phân Tử 
trường ĐHYKPNT và BVĐHYD TpHCM. 
Hình 8: Biểu đồ Bland và Altman 
Hơn thế nữa, biểu đồ Bland và Altman cho 
chúng ta biết kết quả định lượng của 
BVĐHYD theo log10 copies/ml có thể thấp hơn 
0,074 nhưng cũng có thể cao hơn 0,052 so với 
kết quả của bộ môn. Áp dụng vào lâm sàng, 
chúng tôi thấy sự chênh nhau giữa hai kết quả 
là không quá 10 copies/ml. Kế đến, chúng tôi 
thấy trung bình của sự khác biệt gần giá trị 0, 
phương trình y = b + ax có hệ số a và b cũng 
gần với giá trị 0, nên sự khác biệt về kết quả 
giữa hai kỹ thuật là gần như không đáng kể. 
Vậy hai kỹ thuật này có thể thay thế cho 
nhau. 
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 
Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 188 
Tóm lại, các kết quả kể trên chứng tỏ có sự 
tương đồng về mặt kỹ thuật của xét nghiệm Real-
time PCR giữa bộ môn Hóa Sinh – Sinh Học Phân 
Tử trường ĐHYKPNT và BVĐHYD TpHCM. 
KẾT LUẬN 
Định lượng nồng độ HBV – DNA trong máu 
là một thông số sinh học quan trọng và cần thiết 
để đánh giá tình trạng nhiễm HBV, tiên liệu 
chiều hướng phát triển của bệnh và là cơ sở để 
các bác sĩ lâm sàng chỉ định và đánh giá hiệu 
quả điều trị. 
Nghiên cứu này đạt được kết quả như sau: 
Điều kiện tối ưu cho kỹ thuật Real-time 
PCR: 
- Nhiệt độ bắt cặp mồi là 600C. 
- Nồng độ mồi là 400 nM. 
- Nồng độ mẫu dò Taqman là 100 nM. 
- Độ nhạy của phản ứng là 100 copies/ml. 
- Kiểm tra đường chuẩn đã được thiết lập có 
R2 ≥ 0,99 và E% là 100% và hệ số góc là -3,58 là 
đạt chuẩn với cặp mồi được lựa chọn đặc hiệu 
cho virus viêm gan B. 
- Bên cạnh đó, có 34 trường hợp trong tổng 
số 46 người đến xét nghiệm, phát hiện có virus 
viêm gan B và định lượng được số lượng DNA 
đích ban đầu có trong cơ thể. 
- Chất lượng kỹ thuật tương đồng với bệnh 
viện ĐHYD TpHCM. 
Real-time PCR là một kỹ thuật sinh học 
phân tử ngày càng được áp dụng rộng rãi trong 
các lĩnh vực nghiên cứu và điều trị. Qua nghiên 
cứu này, chúng tôi đã thiết lập được kỹ thuật 
Real-time PCR dùng để định lượng HBV – DNA 
với đường chuẩn tự dựng của bộ môn Hóa Sinh 
– Sinh Học Phân Tử trường ĐHYKPNT. Qua đó, 
bộ môn có thể tiến hành làm thường quy xét 
nghiệm này trong phát hiện, điều trị và theo dõi 
bệnh nhân viêm gan B. Chúng tôi hy vọng rằng 
kỹ thuật này sẽ là công cụ hỗ trợ cho những 
nghiên cứu tiếp theo. 
Tuy nhiên nghiên cứu vẫn không thể tránh 
khỏi những hạn chế do thời gian tiến hành 
tương đối ngắn và về tài chính không đủ nên số 
lượng mẫu chưa đủ lớn. Chúng tôi hy vọng 
trong thời gian tới sẽ có những đề tài tiếp tục 
đánh giá trên số lượng mẫu lớn hơn và so sánh 
với các phương pháp định lượng khác, ứng 
dụng Real-time PCR trong việc theo dõi hiệu 
quả điều trị ở những bệnh nhân bị viêm gan B, 
cũng như ứng dụng đường chuẩn tự dựng này 
với những bộ Kit khác giúp giảm giá thành của 
xét nghiệm. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. AASLD. "American Association for the Study of Liver Diseases". 
Available from:  
2. Bland J M, Altman D G. (1995): "Comparing methods of 
measurement: why plotting difference against standard method 
is misleading. Lancet". 346(8982):1085-7. 
3. Bland J M, Altman D G. (1986): "Statistical methods for assessing 
agreement between two methods of clinical measurement. 
Lancet".1(8476):307-10. 
4. Bustin S A. (2002): "Quantification of mRNA using real-time 
reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. J Mol 
Endocrinol".29(1):23-39. 
5. Đỗ Đình Hồ, Đỗ Như Hiền. (2006): "Giáo trình Sinh Học Phân Tử 
(trường Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch)". 
6. Gurtsevitch V E. (2008): "Human oncogenic viruses: hepatitis B 
and hepatitis C viruses and their role in hepatocarcinogenesis. 
Biochemistry (Mosc)". 73(5):504-13. 
7. Hendricks D A, Stowe B J, Hoo B S, Kolberg J, Irvine B D, 
Neuwald P D, et al. (1995): "Quantitation of HBV DNA in 
human serum using a branched DNA (bDNA) signal 
amplification assay. Am J Clin Pathol". 104(5):537-46. 
8. Huy T T, Ushijima H, Win K M, Luengrojanakul P, Shrestha P 
K, Zhong Z H, et al. (2003): "High prevalence of hepatitis B virus 
pre-s mutant in countries where it is endemic and its relationship 
with genotype and chronicity. J Clin Microbiol".41(12):5449-55. 
9. Konnick E Q, Erali M, Ashwood E R, Hillyard D R. (2005): 
"Evaluation of the COBAS amplicor HBV monitor assay and 
comparison with the ultrasensitive HBV hybrid capture 2 assay 
for quantification of hepatitis B virus DNA. J Clin Microbiol". 
43(2):596-603. 
10. Ngô Như Hòa, Lê Trường Giang. (1997): "Thống Kê Y Học". 
11. Pas S D, Fries E, De Man R A, Osterhaus A D, Niesters H G. 
(2000): "Development of a quantitative real-time detection assay 
for hepatitis B virus DNA and comparison with two commercial 
assays. J Clin Microbiol".38(8):2897-901. 
12. Pawlotsky J M. (2003): "Hepatitis B virus (HBV) DNA assays 
(methods and practical use) and viral kinetics. J Hepatol". 39 
Suppl 1:S31-5. 
13. Payungporn S, Tangkijvanich P, Jantaradsamee P, 
Theamboonlers A, Poovorawan Y. (2004): "Simultaneous 
quantitation and genotyping of hepatitis B virus by real-time 
PCR and melting curve analysis. J Virol Methods".120(2):131-40. 
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Nghiên cứu Y học
Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 189 
14. Phạm Hùng Vân. (2009): "PCR và Real-time PCR Các vấn đề cơ 
bản và các áp dụng thường gặp". 
15. Sitnik R, Paes A, Mangueira C P, Pinho J R. (2010): "A real-time 
quantitative assay for hepatitis B DNA virus (HBV) developed to 
detect all HBV genotypes. Rev Inst Med Trop Sao 
Paulo".52(3):119-24. 
16. WHO. World Health Organization. Available from: 
/en/index.html. 
17. Zhao J R, Bai Y J, Zhang Q H, Wan Y, Li D, Yan X J.(2005): 
"Detection of hepatitis B virus DNA by real-time PCR using 
TaqMan-MGB probe technology. World J Gastroenterol". 
11(4):508-10.