Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của peptit tái tổ hợp PEP-H

 30 
25(1): 30-34 Tạp chí Sinh học 3-2003 
Ph−ơng pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn 
của peptit tái tổ hợp PEP-H 
lê quang huấn 
Viện Công nghệ sinh học 
Trong những năm gần đây, sự kháng thuốc 
của vi sinh vật gây bệnh ngày càng gia tăng. 
Nhiều loại thuốc kháng sinh mới đ* nhanh 
chóng mất hiệu lực, đồng thời xuất hiện các 
bệnh nhiễm virut mang tính toàn cầu nh− HIV, 
viêm gan B, C, viêm màng n*o... đang là mối 
quan tâm đặc biệt của các quốc gia cũng nh− các 
nhà khoa học trên toàn thế giới. Vì vậy, các nhà 
khoa học không ngừng tìm kiếm các loại vacxin 
mới, các loại kháng sinh mới với những cơ chế 
tác động khác với cơ chế tác động của các loại 
kháng sinh thông th−ờng, đồng thời có hiệu lực 
kháng khuẩn mạnh và đặc hiệu. Một trong 
những h−ớng nghiên cứu tìm kiếm đó là các loại 
thuốc kháng sinh có bản chất peptit. Ngoài các 
peptit tự nhiên đ−ợc tách chiết từ động thực vật, 
còn có các peptit tái tổ hợp cũng đang đ−ợc các 
nhà nghiên cứu đặc biệt quan tâm. 
Để góp phần nghiên cứu các peptit có hoạt 
tính kháng khuẩn ứng dụng trong y học, trong 
thời gian qua, chúng tối đ* tiến hành nghiên cứu 
hoạt tính kháng khuẩn của peptit tái tổ hợp [2,3, 
4] dựa trên tình tự nucleotit của peptit kháng 
khuẩn đ* đ−ợc tìm thấy trong sam biển 
Tachypleus tridentatus mà các tác giả Nhật Bản 
đ* công bố tr−ớc đây [5]. 
Trong bài này, chúng tôi trình bầy ph−ơng 
pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của peptit 
tái tổ hợp PEP-H. 
I. ph−ơng pháp nghiên cứu 
1. Nguyên liệu 
Dựa trên trình tự peptit tachypleusin, một 
peptit trong máu sam biển (horshoe crab: 
Tachypleus tridentatus) cũng nh− tính chất của 
các amino axít, chúng tôi thiết kế đoạn 
oligonucleotit có trình tự nh− sau: 
5’-AATTCATGAGAAGTGGTGTTATAGAAAGAAACCATATAGAAAATGTAGATGA-3’ 
3’-GTACTCTTCTACCACAATATCTTTCTTTGGTATATCTTTTACATCTACTTCGA-5’ 
Trình tự nucleotit của đoạn gien này đ−ợc 
h*ng GENSET Singapore Biotech. Pte Ltd. tổng 
hợp d−ới dạng các sợi độc lập theo ph−ơng pháp 
hóa học. Chủng vi sinh vật Esherichia coli BL21; 
Vectơ biểu hiện pMAL-C2; Các hóa chất sử 
dụng trong thí nghiệm: IPTG (isopopyl β-D- 
thiogalactopyranosit) (Sigma), sephadex G-75, 
sephadex G-25 (Sigma), cột sắc ký ái lực 
amyloza resin của h*ng New England Biolab, 
maltoza (Sigma), factơ Xa và các hóa chất sử 
dụng khác đều là những hóa chất tinh khiết. Môi 
tr−ờng nuôi cấy vi sinh vật: môi tr−ờng lỏng LB 
(2% trypton, 1% yeast extract, 1% NaCl); môi 
tr−ờng chọn lọc là môi tr−ờng LB bổ sung 
ampixillin nồng độ 100 àg/ml. 
2. Ph−ơng pháp 
a) Nuôi cấy vi khuẩn 
Chủng vi khuẩn biểu hiện peptit tái tổ hợp là 
E. coli BL21 mang gien tái tổ hợp đ−ợc nuôi trên 
môi tr−ờng LB cho đến khi đạt OD600 = 0,5, bổ 
sung chất cảm ứng IPTG với nồng độ 0,3 mM, 
và tiếp tục nuôi lắc (200 vòng/phút) ở 37oC, thời 
gian 180 phút. 
b) Tách chiết protein liên kết 
Từ 300 ml dịch nuôi cấy tế bào, sau khi cảm 
ứng 3 giờ, đ−ợc ly tâm với vận tốc 5000 
vòng/phút ở 4oC trong 20 phút, phần tế bào kết 
lắng đ−ợc hòa lại trong 15 ml dung dịch đệm 
(10 mM Tris-HCl, pH = 8,0; 1 mM EDTA). Sau 
đó, sự thủy giải tế bào đ−ợc thực hiện bằng siêu
 31
âm hoặc enzym lysozym (100 àg/ml). 
Lấy 1 ml dịch thủy giải tế bào đ−a lên cột ái 
lực amyloza resin. Sau khi rửa cột với 15 ml 
dung dịch đệm (20 mM Tris-HCl, pH = 8,0, 1 
mM EDTA, 200 mM NaCl), protein liên kết 
đ−ợc giải hấp với dung dịch đệm trên có bổ 
sung maltoza (20 mM Tris-HCl, pH = 8,0, 1 
mM EDTA, 200 mM NaCl, 10 mM maltoza). 
Thu 10 phân đoạn ngay sau khi cho dung dịch 
giải hấp, mỗi phân đoạn 1 ml. Xác định các 
phân đoạn chứa protein liên kết, xử lý với factơ 
Xa để tách protein MalE và peptit tái tổ hợp 
Protein liên kết đ−ợc cắt bằng factơ Xa trong 
đệm TE có bổ sung 20 mM CaCl2 ở nhiệt độ 
23oC, trong thời gian 16 giờ. Sau đó dịch protein 
đ* cắt bằng factơ Xa đ−ợc sác ký ái lực qua cột 
amyloza resin (cột sắc ký 1 ì 1 cm). Thu các 
phân đoạn (10 phân đoạn, 300 àl/phân đoạn) 
ngay sau khi cho dung dịch protein. Hoạt tính 
kháng khuẩn của peptit ở các phân đoạn đ−ợc 
kiểm tra theo ph−ơng pháp vòng kháng khuẩn. 
c) Xác định hoạt tính kháng khuẩn của peptit 
Các chủng vi khuẩn sử dụng trong phép thử: 
E. coli DH-5α và Pseudomonas aeruginosa 
Môi tr−ờng và hóa chất: 
- Trypticaza soy broth (TBS, Difco, 
Detroit, MI): hòa 30 g TBS trong 1 lit n−ớc 
cất khử ion (dH2O), khử trùng 20 phút ở 
nhiệt dộ 121oC, bảo quản ở nhiệt độ phòng. 
- Đệm phốtphát: dung dịch stock (100 mM), 
hòa riêng biệt 15,6 g NaH2PO4.2.H2O; 26,8 g 
Na2HPO4.7.H2O trong 1 lit dH2O. Pha dung dịch 
đệm phốtphát (100 mM) có pH là 7,4 hoặc 6,5 
bằng cách trộn hai dung dịch theo tỷ lệ nhất 
định cho đến khi đạt pH mong muốn. Khử trùng 
hoặc lọc qua màng lọc (0,45àm), bảo quản ở 
nhiệt độ phòng. 
- Agaroza (sigma): sử dụng agaroza để hạn 
chế tới mức tối thiểu sự t−ơng tác của các peptit 
mang điện tích d−ơng với agar là điều cần thiết 
khi xác định hoạt tính kháng khuẩn của peptit . 
- Lớp gel d−ới: trộn 50 ml đệm phốtphát 100 
mM với 5 ml TSB, thêm 5 g agaroza, thêm 
dH2O đủ 500 ml, chỉnh pH = 7,4 hoặc 6,5 bằng 
1N NaOH hoặc HCl. Khử trùng. Bảo quản ở 
nhiệt độ phòng. Tr−ớc khi sử dụng, có thể làm 
nóng chảy bằng lò vi sóng hoặc trong bể n−ớc 
nóng 42oC. 
- Lớp gel trên: hòa tan 60 g trypticaza soy 
broth (sigma) và 10 g agaroza trong 1 lit dH2O. 
Khử trùng và bảo quản ở nhiệt độ phòng. Tr−ớc 
khi sử dụng, có thể làm nóng chảy bằng lò vi 
sóng hoặc trong bể n−ớc nóng 420C. 
- Dung dịch 10 mM phốtphát, pH = 7,4 đ−ợc 
chuẩn bị từ dung dịch 100 mM, khử trùng và 
bảo quản ở nhiệt độ phòng. Dung dịch đệm này 
đ−ợc làm lạnh tr−ớc khi rửa tế bào. 
Quy trình thử nghiệm: 
1. Cấy chuyển một khuẩn lạc vào 50 ml TSB, 
nuôi lắc (200 vòng/phút), 37oC, 18-24 giờ. 
2. Cấy chuyển 50 àl (đối với tế bào là E.coli) 
vào 50 ml môi tr−ờng TSB mới và nuôi tiếp 
2,30 giờ ở 37oC trong máy lắc. 
3. Ly tâm thu tế bào: 400 vòng/phút, 10 phút ở 
4oC. 
4. Rửa tế bào với 10 ml dung dịch đệm 
phốtphát (pH = 7,4) đ* làm lạnh, ly tâm thu 
tế bào nh− b−ớc 3. Sau đó hòa lại tế bào 
trong 5 ml dung dịch đệm phốtphát (pH = 
7,4) đ* làm lạnh. 
5. Lấy 1 ml dịch tế bào vừa thu đ−ợc đo phổ 
hấp thụ. Kết quả xác định OD620 sẽ cho phép 
tính toán và pha phần dịch tế bào còn lại (4 
ml) tới nồng độ 4.106 CFU (công thức tính 
nh− sau: CFU/ml= OD620 ì 2,5.10
8). 
6. Lấy 10 ml dung dịch gel d−ới cho vào ống 
ly tâm dung tích 15 ml và bổ sung 4.106 
CFU, vortex 15 giây, đổ lên đĩa petri, để gel 
đông chặt khoảng 2 phút. 
7. Đặt đĩa lên trên tờ giấy kẻ ôly và đục giếng 
theo số l−ợng: 4 ì 4 hoặc 5 ì 5. 
8. Cho 5 àl các mẫu peptit cần thử nghiệm vào 
các giếng đ* đục (peptit đ−ợc pha trong 
0,01% axít axetic). Đậy đĩa petri và nuôi 
trong 3 giờ ở 37oC. 
9. Bổ sung thêm 10 ml lớp gel trên giầu dinh 
d−ỡng vào các đĩa; sau khi gel đông chặt 
đậy đĩa petri và nuôi tiếp qua đêm ở 37oC. 
10. Sáng hôm sau, bổ sung 10 ml dung dịch tẩy 
lên bề mặt đĩa (dung dịch tẩy: 5% axit 
axetic trong 25% metanol); sau 20 phút, xác 
định bán kính vòng kháng khuẩn. 
II. Kết quả và thảo luận 
1. Thiết kế vectơ mang gien peptit tái tổ hợp 
 32 
Gien tổng hợp sau khi đ−ợc gắn vào vectơ 
pMAL-C2 nhờ các enzym giới hạn E.CoR1 và 
HindIII, đ−ợc biến nạp vào chủng vi khuẩn E. 
coli DH5α và chọn lọc trên môi tr−ờng LB chứa 
ampixillin (100 àg/ml). 
Để kiểm tra kết quả biến nạp, chúng tôi đ* 
tiến hành tách chiết ADN của plasmit pMAL-
C2 mang gien peptit tái tổ hợp và cắt ADN 
plasmit bằng các enzym giới hạn E.CoR1 và 
Hind III, sau đó kiểm tra bằng điện di trên gel 
polyacrylamit. Kết quả trên điện di đồ thu đ−ợc 
2 băng ADN, một băng t−ơng ứng với ADN có 
trọng l−ợng phân tử lớn và một băng có trọng 
l−ợng phân tử t−ơng ứng với trọng l−ợng phân tử 
của đoạn oligonucleotit tổng hợp (hình 1). 
Hình 1. Kết quả điện di ADN plasmit sau khi cắt bằng các enzym E.CoR I và Hind III 
Các giếng 1, 2, 3: ADN plasmit các khuẩn lạc sau khi xử lý với E.CoR I và Hind III 
Các giếng 4, 5: Đoạn oligonucleotit tổng hợp 
Từ các kết quả trên đây, có thể khẳng định 
rằng đoạn oligonucleotit do chúng tôi tổng hợp 
đ* đ−ợc gắn vào vectơ pMAL-C2 và thay thế 
cho đoạn polylinker của pMAL-C2. Vị trí của 
đoạn oligonucleotit nằm giữa vị trí nhận biết của 
các enzym giới hạn E.CoR1 và HindIII. 
2. Biểu hiện gien tái tổ hợp 
Sau khi biến nạp vectơ pMAL-C2 mang gien 
peptit tái tổ hợp vào chủng vi khuẩn E. coli BL-
21, các tế bào vi khuẩn đ* biến nạp đ−ợc nuôi
cấy trên môi tr−ờng LB chứa kháng sinh 
ampixillin (100 àg/ml) cho tới khi đạt nồng độ 
OD600 = 0,5, bổ sung chất cảm ứng IPTG tới 
nồng độ cuối cùng là 0,3 mM. Nuôi tiếp trong 3 
giờ ở 37oC, sau đó thu nhận tế bào và tách chiết 
protein vi khuẩn. 
Kết quả kiểm tra sự biểu hiện của gien sau 
khi cảm ứng bằng IPTG bằng điện di trên gel 
polyacrylamit SDS-PAGE đ−ợc trình bầy trên 
hình 2. 
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 
Hình 2. Điện di đồ của protein tế bào vi khuẩn tr−ớc và sau khi cảm ứng bằng IPTG 
Giếng 5: Marker protein; Các giếng 1, 3, 6, 8 là protein tr−ớc khi cảm ứng bằng IPTG 
Các giếng 2, 4, 7, 9 là protein sau khi cảm ứng bằng IPTG. 
Đoạn ADN sau 
khi cắt bằng 2 
enzym Đoạn oligonucleotit tổng hợp 
 1 2 3 4 5 
 43 kDa 
 33
Trên hình 2, sau khi cảm ứng bằng IPTG, ta 
thấy l−ợng protein có trọng l−ợng phân tử 
khoảng 43 kDa xuất hiện rất rõ so với tr−ớc khi 
gây cảm ứng. Điều này có nghĩa là gien tái tổ 
hợp trong vectơ đ* hoạt động mạnh (tổng hợp 
một l−ợng lớn protein tái tổ hợp) sau khi bổ 
sung IPTG vào môi tr−ờng nuôi cấy. 
3. Tinh chế peptit 
Pha lo*ng dịch phá tế bào bằng đệm TE (TE: 
50mM Tris-HCl, pH = 7,4, 0,1% EDTA và 100 
mM NaCl). Sau đó, cho lên cột sắc ký ái lực với 
chất amyloza resin, giải hấp bằng đệm TE có bổ 
sung maltoza. Các phân đoạn chứa protein liên 
kết đ−ợc kiểm tra bằng điện di trên SDS-PAGE. 
Kết quả thu đ−ợc một băng protein có trọng 
l−ợng phân tử khoảng 43 kDa (hình 3). 
Hình 3. Điện di đồ các phân đoạn thu đ−ợc bằng sắc ký ái lực trên amyloza resin 
Giếng 1: Marker protein 
Các giếng 2, 3, 4, 5, 6: Protein của các phân đoạn thu đ−ợc sau khi bổ sung maltoza. 
Protein liên kết, sau khi tinh chế trên cột sắc 
ký ái lực, đ−ợc cắt bằng factơ Xa trong đệm TE 
có bổ sung 20 mM CaCl2 ở nhiệt độ 23
oC, thời 
gian 16 giờ. Sau đó dịch protein đ* cắt bằng factơ 
Xa đ−ợc sắc ký ái lực qua cột amyloza resin (cột 
sắc ký 1 ì 1 cm). Thu các phân đoạn (10 phân 
đoạn, 300 àl/phân đoạn) ngay sau khi cho dung 
dịch protein. Hoạt tính kháng khuẩn của peptit ở 
các phân đoạn đ−ợc kiểm tra theo ph−ơng pháp 
vòng kháng khuẩn. Kết quả cho thấy, ở phân 
đoạn thứ 4, khả năng ức chế sự phát triển của vi 
khuẩn là rất rõ. Kết quả xác định hoạt tính kháng 
khuẩn của peptit theo ph−ơng pháp vòng kháng 
khuẩn đ−ợc trình bày trên hình 4. 
Hình 4. Khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gram d−ơng Bacillus subtilis 
Giếng 4: phân đoạn 3 sau sắc ký ái l−c có sự ức chế đối với Bacillus subtilis 
Các giếng 1, 2, 3, 5: Các phân đoạn 1, 2, 4, 5 sau sắc ký ái lực không có hoạt tính. 
1 
2 
3 
4 5 
 1 2 3 4 5 6 
Phân đoạn sau sắc 
ký ái lực 
43 kDa 
 34 
iii. Kết luận 
1. Đoạn oligonucleotit tổng hợp m* hóa cho 
một peptit tái tổ hợp đ* đ−ợc gắn vào vectơ 
pMAL-C2 giữa điểm nhận biết của các enzym 
giới hạn ECoR1 và HindIII và biểu hiện tốt 
trong tế bào vi khuẩn E. coli BL21. 
2. Protein liên kết đ−ợc tế bào vi khuẩn E.coli 
BL21tổng hợp với một l−ợng lớn sau khi cảm 
ứng bằng IPTG và thu đ−ợc protein sạch chỉ cần 
một b−ớc tinh chế trên cột ái lực amyloza resin. 
3. Đ* xây dựng đ−ợc ph−ơng pháp xác định 
hoạt tính kháng khuẩn thích hợp, có độ nhạy cần 
thiết để xác định hoạt tính của peptit tái tổ hợp 
nói riêng, các peptit nói chung. 
tài liệu tham khảo 
1. Bechinge B., Zasloff M., Opella Sj., 1993: 
Protein Sci., 2(12): 2077-2084. 
2. Birney M. H. and Penney D. G., 1990: 
Heart Lung, 19(2): 174-183. 
3. Blondelle S. E., 1995: J. Appl. Bacteriol ., 
78: 39-46. 
4. Boma H. G., 1995: Annu. Rev. Immun., 
13: 61-92. 
5. Nakamura T. et al., 1998: J. Biol. Chem., 
263: 16709-16713. 
method for detection of the antimicrobial activity 
of the recombinantial peptide PEP-H 
le quang huan 
summary 
The gene encoding the recombinant peptide has been synthesized by chemical method and it was 
sucessfully expressed in E. coli. The new method was developed for detection of the antimicrobial activities of 
the pure recombinant peptide which after has been purified on affinity chromatography and cleaved by the 
factor Xa. 
Ngày nhận bài: 14-1-2002