Xây dựng hệ thống tái sinh bạch đàn Urô (Eucalyptus urophylla S.T. Blake) từ mô sẹo phục vụ chọn dòng tế bào

TÓM TẮT Tái sinh bạch đàn thông qua tạo đa chồi trực tiếp từ mô sẹo đã được xây dựng thành công. Kết quả cho thấy, dùng đoạn thân mầm 8 -10 ngày tuổi nuôi trên môi trường khoáng MS bổ sung 0,4 mg/l NAA, 0,2 mg/l IBA, 0,2 mg/l BAP, 100 ml/l nước dừa, 20 g/l sucrose, 7 g/l agar, nuôi trong tối 2 tuần, sau đó chuyển ra nuôi sáng với cường độ ánh sáng 2000 lux cho tỉ lệ tạo mô sẹo 97,8%. Tái sinh đa chồi trực tiếp từ mô sẹo trên môi trường khoáng MS bổ sung 0,6 mg/l BAP, 0,1 mg/l Kinetin, 0,3 mg/l NAA, 100 ml/l nước dừa, 20 g/l sucrose, 7 g/l agar, nuôi dưới ánh đèn neon 2000 lux cho tỷ lệ tái sinh chồi đạt 71,8% và số chồi trung bình/mẫu đạt 8,5 sau 4 tuần nuôi cấy. Kích thích ra rễ tạo cây hoàn chỉnh trên môi trường khoáng cơ bản MS bổ sung 0,3 mg/l NAA, 0,2 mg/l IBA, 20 g/l sucrose,7 g/l agar, tỷ lệ ra rễ đạt 92.4%. Cây hoàn chỉnh được chuyển ra trồng trong bầu đất với thành phần ruột bầu là đất, cát sạch (1:1), tỷ lệ sống đạt 89%. Hệ thống tái sinh cây bạch đàn hiệu suất cao có thể áp dụng trong tạo giống bạch đàn bằng phương pháp chọn dòng tế bào mang biến dị soma có khả năng chịu mặn

pdf 8 trang yennguyen 1260
Bạn đang xem tài liệu "Xây dựng hệ thống tái sinh bạch đàn Urô (Eucalyptus urophylla S.T. Blake) từ mô sẹo phục vụ chọn dòng tế bào", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên

Tóm tắt nội dung tài liệu: Xây dựng hệ thống tái sinh bạch đàn Urô (Eucalyptus urophylla S.T. Blake) từ mô sẹo phục vụ chọn dòng tế bào

Xây dựng hệ thống tái sinh bạch đàn Urô (Eucalyptus urophylla S.T. Blake) từ mô sẹo phục vụ chọn dòng tế bào
Công nghệ sinh học & Giống cây trồng 
 26 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP THÁNG 10/2017 
XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH BẠCH ĐÀN URÔ 
(Eucalyptus urophylla S.T. Blake) 
TỪ MÔ SẸO PHỤC VỤ CHỌN DÒNG TẾ BÀO 
Nguyễn Thị Hường1, Nguyễn Văn Việt2 
1,2Trường Đại học Lâm nghiệp 
TÓM TẮT 
Tái sinh bạch đàn thông qua tạo đa chồi trực tiếp từ mô sẹo đã được xây dựng thành công. Kết quả cho thấy, 
dùng đoạn thân mầm 8 -10 ngày tuổi nuôi trên môi trường khoáng MS bổ sung 0,4 mg/l NAA, 0,2 mg/l IBA, 
0,2 mg/l BAP, 100 ml/l nước dừa, 20 g/l sucrose, 7 g/l agar, nuôi trong tối 2 tuần, sau đó chuyển ra nuôi sáng 
với cường độ ánh sáng 2000 lux cho tỉ lệ tạo mô sẹo 97,8%. Tái sinh đa chồi trực tiếp từ mô sẹo trên môi 
trường khoáng MS bổ sung 0,6 mg/l BAP, 0,1 mg/l Kinetin, 0,3 mg/l NAA, 100 ml/l nước dừa, 20 g/l sucrose, 
7 g/l agar, nuôi dưới ánh đèn neon 2000 lux cho tỷ lệ tái sinh chồi đạt 71,8% và số chồi trung bình/mẫu đạt 8,5 
sau 4 tuần nuôi cấy. Kích thích ra rễ tạo cây hoàn chỉnh trên môi trường khoáng cơ bản MS bổ sung 0,3 mg/l 
NAA, 0,2 mg/l IBA, 20 g/l sucrose,7 g/l agar, tỷ lệ ra rễ đạt 92.4%. Cây hoàn chỉnh được chuyển ra trồng trong 
bầu đất với thành phần ruột bầu là đất, cát sạch (1:1), tỷ lệ sống đạt 89%. Hệ thống tái sinh cây bạch đàn hiệu 
suất cao có thể áp dụng trong tạo giống bạch đàn bằng phương pháp chọn dòng tế bào mang biến dị soma có 
khả năng chịu mặn. 
Từ khóa: Bạch đàn Urô, đa chồi, đoạn thân mầm, mảnh lá mầm, mô sẹo, tái sinh. 
I. ĐẶT VẤN ĐỀ 
Việt Nam là quốc gia giáp biển với bờ biển 
dài và thảm thực vật phong phú. Trước áp lực 
của sự biến đổi khí hậu, các giống cây bản địa 
ngày càng bị thu hẹp diện tích sống do tình 
trạng nước biển dâng. Vì vậy, các nhà khoa 
học đang hướng đến giải pháp tạo ra một số 
loài cây có thể sống và sinh trưởng tốt trên 
những khu vực có điều kiện khí hậu bất thuận 
như nóng, lạnh, hạn hoặc những vùng đất bị 
nhiễm phèn, mặn. 
Bạch đàn (Eucalyptus) là cây gỗ cứng quan 
trọng, có nguồn gốc từ Úc. Bạch đàn được 
trồng rừng với diện tích lớn và phổ biến nhất, 
ước tính khoảng 20 triệu ha trên toàn thế giới, 
đặc biệt trồng nhiều ở Trung Quốc, Ấn Độ, 
Nam Mỹ và Đông Nam Á (FAO, 2000). Các 
chi bạch đàn gồm hơn 700 loài và các giống 
lai, nhiều loài có giá trị kinh tế cao như loài E. 
Camaldulensis, E. grandis, E. globulus, E. 
urophylla và giống bạch đàn lai là các loài 
đang được gây trồng rừng chủ yếu. 
Trong những năm gần đây, công nghệ nuôi 
cấy mô tế bào thực vật đã ra đời và đang không 
ngừng phát triển, thu được rất nhiều những 
thành tựu nổi bật, có vị trí quan trọng trong 
lĩnh vực sản xuất giống cây trồng. Ưu điểm nổi 
bật của phương pháp này là có thể tạo được số 
lượng cây con lớn trong thời gian ngắn, giữ 
được đặc tính di truyền ổn định, đồng đều về 
kiểu hình, các cá thể phát triển bình thường, 
khỏe mạnh (Lê Trần Bình và cộng sự, 1997). 
Tái sinh cụm chồi in vitro trực tiếp từ mô sẹo 
đã và đang được nghiên cứu mạnh nhằm phục 
vụ cho công tác nhân giống, chọn tạo giống 
cây trồng nông lâm nghiệp (Dương Tấn Nhựt 
và cộng sự, 2007). Đây là kỹ thuật giúp điều 
khiển sự phát sinh hình thái của thực vật một 
cách có định hướng dựa vào sự phân hóa và 
phản phân hóa trên cơ sở tính toàn năng của tế 
bào thực vật nhằm tạo ra cây hoàn chỉnh từ vật 
liệu in vitro. Quy trình tái sinh một số loài 
bạch đàn cũng đã được báo cáo: 
Bandyopadhyay và cộng sự (1999) đã tái sinh 
thành công loài bạch đàn E. nitens và E. 
globules từ thân mầm; Cid và cộng sự (1999) 
tái sinh thành công loài bạch đàn lai E. grandis 
x E. urophylla từ vật liệu lá mầm; Dibax và 
cộng sự (2010) tái sinh loài bạch đàn E. 
cammaldulensis từ mảnh lá mầm; Huang và 
Công nghệ sinh học & Giống cây trồng 
 27TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP THÁNG 10/2017 
cộng sự (2010) cũng báo cáo tái sinh thành 
công loài bạch đàn Eucalyptus urophylla từ 
đỉnh thân mầm. Cho đến nay, nhiều loài bạch 
đàn đã được nghiên cứu tái sinh thành công 
thông qua tạo đa chồi hoặc phôi soma. Tuy 
vậy, các kết quả nghiên cứu thu được cho thấy 
ở mỗi loài bạch đàn, thậm chí ở các dòng trong 
cùng một loài thì khả năng tái sinh có thể khác 
nhau (Alves và cộng sự, 2004; Dibax và cộng 
sự, 2005; Hajari và cộng sự, 2006). Kết quả 
của nghiên cứu này sẽ là cơ sở khoa học về xây 
dựng hệ thống tái sinh thông qua tạo đa chồi 
trực tiếp từ mô sẹo có nguồn gốc khác nhau đạt 
hiệu quả cao phục vụ cho công tác tạo giống 
cây trồng có khả năng chống chịu các điều 
kiện bất lợi. 
II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
2.1. Vật liệu nghiên cứu 
Hạt giống và vật liệu cành bánh tẻ Bạch đàn 
Urô (Eucalyptus urophylla) được cung cấp từ 
Viện Nghiên cứu cây nguyên liệu giấy tại xã 
Phù Ninh, huyện Phù Ninh, tỉnh Phú Thọ. 
2.2. Phương pháp nghiên cứu 
2.2.1. Phương pháp nghiên cứu chung 
Bố trí thí nghiệm theo phương pháp sinh 
học thực nghiệm, lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại 
có dung lượng mẫu lớn (n ≥ 30), kết quả là giá 
trị trung bình của các lần lặp, khử trùng môi 
trường nuôi cấy ở nhiệt độ 1180C, áp suất 1 
atm, môi trường có pH = 5,8. Cường độ chiếu 
sáng 2.000 – 3.000 lux, nhiệt độ phòng nuôi 24 
± 20C. 
2.2.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm 
Thí nghiệm 1: Tạo mẫu sạch và tái sinh chồi 
in vitro 
Hạt bạch đàn đã được tuyển lựa theo tiêu 
chuẩn TCVN 5378:1991 về hạt giống lâm 
nghiệp; mẫu cành bánh tẻ được cắt từ những 
cây sinh trưởng tốt, không sâu bệnh, mỗi đoạn 
cành có chiều dài 20 - 30 cm, đường kính 0,2 – 
0,3 cm, loại bỏ phần quá non. Tiếp theo, mẫu 
được làm sạch bằng xà phòng loãng (10%) sau 
đó sát khuẩn bề mặt bằng ethanol 70% trong 1 
phút. Khử trùng mẫu bằng Javen 6% với các 
thời gian khác nhau (3 - 11 phút). Sau khi khử 
trùng, mẫu được cấy trên môi trường khoáng cơ 
bản MS bổ sung 20 g/l sucrose, 7 g/l agar để tái 
sinh chồi in vitro. 
Thí nghiệm 2: Cảm ứng tạo mô sẹo từ các 
vật liệu khác nhau 
Khi hạt nảy mầm tạo thành cây, mẫu cành 
đã tái sinh chồi non. Thu nhận cây mầm, lá 
mầm và chồi non, sau đó cắt mẫu thành các 
mảnh nhỏ (cắt lá thành mảnh nhỏ 0,5 cm2; cắt 
thân mầm thành đoạn 0,5 cm) và nuôi cấy trên 
môi trường khoáng cơ bản MS bổ sung (0,2 – 
1,2 mg/l) NAA, (0,2 - 0,3 mg/l) IBA, (0,1 – 0,6 
mg/l) BAP, 100 ml/l nước dừa, 20 g/l sucrose, 
7 g/l agar, nuôi tối hai tuần sau đó chuyển ra 
nuôi sáng. 
Thí nghiệm 3: Tái sinh chồi trực tiếp từ mô sẹo 
Mô sẹo được tạo ra từ các vật liệu khác 
nhau được nuôi cấy trên môi trường khoáng cơ 
bản MS bổ sung (0,2 – 1,2 mg/l) BAP, (0,1 - 
0,2 mg/l) Kinetin, (0,1 – 0,6 mg/l) NAA, 
100ml/l nước dừa, 20 g/l sucrose, 7 g/l agar. 
Thí nghiệm 4: Kích thích ra rễ tạo cây 
hoàn chỉnh 
Cắt chồi hữu hiệu (cao 2 – 2,5 cm) nuôi trên 
môi trường khoáng cơ bản MS bổ sung 0,5 
mg/l NAA, 0,2 mg/l IBA, 20 g/l sucrose và 7 
g/l agar. 
2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu 
Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê sinh 
học ứng dụng các phần mềm đã lập trình trên 
máy tính điện tử như Excel và SPSS. 
2.3. Địa điểm nghiên cứu 
Nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí 
nghiệm Công nghệ tế bào, Viện Công nghệ sinh 
học Lâm nghiệp - Trường Đại học Lâm nghiệp. 
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 
3.1. Tạo mẫu sạch và tái sinh chồi in vitro 
Mẫu hạt bạch đàn sau khi được làm sạch 
Công nghệ sinh học & Giống cây trồng 
 28 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP THÁNG 10/2017 
được khử trùng bằng dung dịch javen 6% với 5 
công thức thí nghiệm bố trí khác nhau về thời 
gian. Sau 20 ngày nuôi cấy trên môi trường 
nuôi cấy khởi đầu, kết quả được trình bày ở 
bảng 1. 
Bảng 1. Kết quả tạo mẫu sạch và khả năng tái sinh chồi 
Công thức 
khử trùng 
Mẫu hạt Mẫu cành bánh tẻ 
Tỷ lệ mẫu sạch (%) Tỷ lệ nảy mầm (%) Tỷ lệ mẫu sạch (%) 
Tỷ lệ mẫu tái sinh 
(%) 
KT1 = 3
’ 35,6 30,0 5,7 5,5 
KT2 = 5
’ 90,6 82,8 17,3 16,8 
KT3= 7
’ 95,0 61,1 33,7 31,4 
KT4 = 9
’ 96,7 57,2 47,7 18,9 
KT5 = 11
’ 99,4 15,6 71,3 17,8 
 Ftính = 8,48 > F0,05 = 5,99 Ftính = 9,02 > F0,05 = 5,99 
Kết quả cho thấy (bảng 1), tỷ lệ mẫu sạch từ 
vật liệu hạt đạt 35,6 - 99,4%; từ vật liệu cành 
đạt 5,7 - 71,3%. Khả năng tái sinh chồi từ các 
công thức khử trùng cũng khác nhau đáng kể, 
từ vật liệu hạt và cành non có tỷ lệ tái sinh chồi 
cao nhất lần lượt là 82,8 và 31,4%. Như vậy, từ 
các nguồn vật liệu khác nhau đã cho kết quả 
sai khác rõ rệt ở các công thưc khử trùng, với 
thời gian khử trùng càng dài thì tỷ lệ tạo mẫu 
sạch càng cao, nhưng khả năng tái sinh chồi 
càng giảm. Điều này cũng có thể giải thích 
rằng dung dịch javen 6% là một loại hóa chất 
dùng để khử trùng làm sạch mẫu nhưng lại có 
tính độc đối với tế bào thực vật, nếu khử trùng 
thời gian dài thì hóa chất sẽ ngấm vào mô của 
tế bào thực vật gây độc cho phôi và làm cho 
phôi bị chết. Do vậy, trong thí nghiệm này đã 
lựa chọn công thức khử trùng đối với vật liệu 
hạt bạch đàn là KT2 = 5
 phút, vật liệu là cành 
non là KT3 = 7 phút cho hiệu quả tái sinh cao 
nhất. Kết quả phân tích phương cũng cho thấy 
Ftính (vật liệu hạt) > F0,05; Ftính (vật liệu cành) > F0,05, tức 
là thời gian khử trùng khác nhau ảnh hưởng rõ 
rệt đến khả năng tạo mẫu sạch và khả năng tái 
sinh chồi. 
3.2. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh 
trưởng thực vật đến hiệu quả tạo mô sẹo 
Trong giai đoạn cảm ứng tạo mô sẹo, môi 
trường dinh dưỡng có vai trò rất quan trọng 
đến khả năng hình thành các khối mô sẹo, đặc 
biệt là chất điều hòa sinh trưởng. Các nghiên 
cứu cho thấy, auxin và cytokinin là hai nhóm 
chất điều hòa sinh trưởng có ảnh hưởng lớn 
nhất, lượng chất điều hòa sinh trưởng bổ sung 
đối với vật liệu nghiên cứu là lá thường cao 
hơn so với thân. Các mẫu mô sẹo có chất 
lượng tốt là những khối mô sẹo cứng, màu nâu 
đỏ, không bị nhiễm, phát triển tốt. Các thí 
nghiệm tiến hành dưới đây sẽ giúp tìm ra nồng 
độ NAA, IBA, BAP phù hợp cho việc cảm ứng 
hình thành mô sẹo. 
3.2.1. Tạo mô sự từ vật liệu đoạn thân mầm 
Kết quả thí nghiệm về ảnh hưởng của tổ 
hợp chất điều hòa sinh trưởng NAA, IBA, 
BAP đến khả năng cảm ứng tạo mô sẹo của 
đoạn thân sau 4 tuần nuôi cấy được thể hiện ở 
bảng 2. 
Công nghệ sinh học & Giống cây trồng 
 29TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP THÁNG 10/2017 
Bảng 2. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến tạo mô sẹo từ đoạn thân mầm 
CTTN 
Chất ĐHST (mg/l) Tỷ lệ mẫu tạo 
mô sẹo (%) 
Đặc điểm 
mô sẹo 
Chất lượng 
mô sẹo NAA IBA BAP 
ĐC 0 0 0 7,6 - + 
TM1 0,2 0,2 0,1 67,8 xốp + 
TM2 0,4 0,2 0,2 97,8 cứng +++ 
TM3 0,6 0,2 0,3 83,3 cứng +++ 
TM4 0,8 0,3 0,4 82,2 cứng +++ 
TM5 1,0 0,3 0,5 80,0 xốp ++ 
TM6 1,2 0,3 0,6 74,4 xốp + 
 Ftính = 19,37 > F0,05 = 4,60 
Ghi chú: +: mô sẹo có mầu nâu nhạt, kính thước khối mô sẹo nhỏ (đường kính <1 cm) ; ++: mô sẹo có 
mầu trắng, kích thước trung bình (1 cm); +++: mô sẹo có mầu hồng nhạt, kích thước lớn (>1 cm); ++++: 
mô sẹo có mầu hồng, kích thước lớn (>1 cm). 
Từ kết quả của bảng 2 cho thấy, khi bổ sung 
chất điều hòa sinh trưởng vào môi trường nuôi 
cấy, khả năng tạo mô sẹo từ vật liệu là đoạn 
thân khá tốt, tất cả các công thức đều cho tỷ lệ 
mô sẹo cao hơn so với công thức đối chứng. Ở 
công thức không bổ sung chất điều hòa sinh 
trưởng, không có mẫu nào tạo được mô sẹo. 
Khi bổ sung chất điều hòa sinh trưởng có nồng 
độ từ (0,2 – 1,2 mg/l) NAA; (0,2 - 0,3 mg/l) 
IBA và (0,1 – 0,6 mg/l) BAP, khả năng cảm 
ứng tạo mô sẹo có sự thay đổi rõ rệt, chất 
lượng mô sẹo cũng có sự khác nhau, tỷ lệ tạo 
mô sẹo cao nhất đạt 97,8% (hình 1a, b, c) ở 
công thức TM2, khi nồng độ chất điều hòa sinh 
trưởng tiếp tục tăng, tỷ lệ tạo mô sẹo có xu 
hướng giảm dần còn 74,4% (TM6), cùng với 
đó là chất lượng mẫu mô sẹo cũng suy giảm. 
Như vậy, công thức môi trường TM2 có thành 
phần gồm môi trường khoáng cơ bản MS bổ 
sung 0,4 mg/l NAA, 0,2 mg/l IBA, 0,2 mg/l 
BAP, 100 ml/l nước dừa, 20 g/l sucrose, 7 g/l 
agar cho tỷ lệ tạo mô sẹo cao nhất và chất 
lượng mô sẹo tốt. Kết quả phân tích phương 
sai cho thấy Ftính > F0,05, chứng tỏ môi trường 
nuôi cấy có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng 
thực vật khác nhau có ảnh hưởng rõ rệt đến 
khả năng tạo mô sẹo từ đoạn thân mầm. 
3.2.2. Tạo mô sẹo từ mảnh lá mầm 
Tế bào thuộc các mô hoặc các cơ quan đã 
phân hóa của các cây song tử diệp thường phản 
phân hóa dưới tác động của auxin (riêng rẽ hay 
kết hợp với một cytokinin) để cho ra mô sẹo 
(Lê Hồng Giang và cộng sự, 2010). Trong thí 
nghiệm này, chúng tôi nghiên cứu sự ảnh 
hưởng của tổ hợp NAA, IBA và BAP có nồng 
độ khác nhau đến khả năng cảm ứng tạo mô 
sẹo của mảnh lá mầm. Sau 4 tuần nuôi cấy, kết 
quả được trình bày ở bảng 3. 
Bảng 3. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến tạo mô sẹo từ mảnh lá 
CTTN 
Chất ĐHST (mg/l) Tỷ lệ mẫu tạo mô 
sẹo (%) 
Đặc điểm 
mô sẹo 
Chất lượng 
mô sẹo NAA IBA BAP 
ĐC 0 0 0 3,4 - - 
LM1 0,2 0,2 0,1 83,3 xốp ++ 
LM2 0,4 0,2 0,2 80,0 cứng +++ 
LM3 0,6 0,2 0,3 94,4 cứng +++ 
LM4 0,8 0,3 0,4 68,9 cứng +++ 
LM5 1,0 0,3 0,5 38,9 Xốp ++ 
LM6 1,2 0,3 0,6 30,0 xốp + 
 Ftính = 7,90 > F0,05 = 4,61 
Ghi chú: +: mô sẹo có mầu nâu nhạt, đường kính khối mô sẹo nhỏ (<1 cm) ; ++: mô sẹo có mầu trắng, 
đường kính trung bình (1 cm); +++: mô sẹo có mầu hồng nhạt, kích thước lớn (>1 cm) 
Công nghệ sinh học & Giống cây trồng 
 30 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP THÁNG 10/2017 
Qua kết quả bảng 3 cho thấy, tỷ lệ tạo mô 
sẹo của các công thức thí nghiệm bổ sung chất 
điều hòa sinh trưởng có nồng độ khác nhau đã 
cho kết quả khác nhau tương đối rõ rệt. Ở công 
thức đối chứng không bổ sung chất điều hòa 
sinh trưởng, mẫu tạo mô sẹo rất kém, ở các 
công thức thí nghiệm có nồng độ chất điều hòa 
sinh trưởng tăng dần (0,2 – 1,2 mg/l) NAA; 
(0,2 – 0,3 mg/l) IBA; (0,1 - 0,6 mg/l) BAP. Kết 
quả cho thấy rất khác nhau, trong đó tỷ lệ tạo 
mô sẹo tăng dần từ công thức LM1 (83,3%) 
đến công thức LM3 (94,4%), tiếp tục tăng nồng 
độ chất điều hòa sinh trưởng thì tỷ lệ tạo mô 
sẹo giảm đi rõ rệt, tỷ lệ thấp nhất ở công thức 
LM6 (30%), như vậy có thể nói chất điều hòa 
sinh trưởng có ảnh hưởng lớn đến khả năng tạo 
mô sẹo, đặc biệt nồng độ cao có thể gây ức chế 
quá trình hình thành mô sẹo. Thí nghiệm này, 
đã chọn được công thức phù hợp cho tạo mô 
sẹo từ vật liệu mảnh lá mầm là LM3 (với môi 
trường khoáng cơ bản MS bổ sung 0,6 mg/l 
NAA, 0,2 mg/l IBA, 0,3 mg/l BAP, 100 ml/l 
nước dừa, 30 g/l sucrose, 7 g/l agar), cho hiệu 
quả cao về tỷ lệ tạo mô sẹo đạt 94,4% (hình 
1d, e), chất lượng mô sẹo tốt, mầu nâu đỏ, 
cứng. Kết quả phân tích phương sai cho thấy 
Ftính > F0,05, chứng tỏ nồng độ các chất điều hòa 
sinh trưởng khác nhau ảnh hưởng rõ rệt đến 
khả năng tạo mô sẹo từ lá mầm. 
3.3. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh 
trưởng thực vật đến khả năng tái sinh chồi 
Để có được số lượng cây lớn, đòi hỏi mô 
sẹo có khả năng tái sinh lượng lớn chồi, các 
chồi sinh trưởng và phát triển tốt. Trong 
nghiên cứu này, hai nhóm chất điều hòa sinh 
trưởng được sử dụng là auxin và cytokinin, cụ 
thể đó là BAP, Kinetin và NAA. Vật liệu được 
sử dụng là mô sẹo có nguồn gốc từ đoạn thân 
mầm và mảnh lá mầm. 
3.3.1. Tái sinh chồi từ mô sẹo tạo ra từ thân 
mầm 
Kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng nồng độ 
các chất điều hòa sinh trưởng BAP, Kinetin và 
NAA đến sự tái sinh chồi từ mẫu mô sẹo tạo ra 
từ đoạn thân mầm sau 4 tuần nuôi cấy được thể 
hiện trong bảng 4. 
Bảng 4. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến tái sinh chồi từ mô sẹo 
CTTN 
Chất ĐHST (mg/l) Mô sẹo từ thân mầm Mô sẹo từ mảnh lá mầm 
BAP Kinetin NAA 
Tỷ lệ tái sinh 
(%) 
Số chồi 
TB/mẫu 
Tỷ lệ tái sinh 
(%) 
Số chồi 
TB/mẫu 
ĐC 0 0 0 17,8 2,5 18,9 2,9 
TS1 0,2 0,1 0,1 38,9 3,1 34,4 5,4 
TS2 0,4 0,1 0,2 51,1 5,6 54,4 6,1 
TS3 0,6 0,1 0,3 71,8 8,5 56,7 6,8 
TS4 0,8 0,2 0,4 54,4 6,6 67,8 8,3 
TS5 1,0 0,2 0,5 52,2 5,5 58,9 6,6 
TS6 1,2 0,2 0,6 41,1 5,7 47,8 4,9 
 Ftính = 64,62 > F0,05 = 4,75 Ftính = 33,24 > F0,05 = 4,75 
Kết quả cho thấy (bảng 4), ở các công thức 
thí nghiệm có bổ sung các chất điều hòa sinh 
tưởng có nồng độ tăng dần tương ứng với công 
thức TS1 đến TS6. Sau 4 tuần thí nghiệm cho 
kết quả có sự khác nhau rõ rệt, với các công 
thức từ TS1 đến TS3, nồng độ chất điều hòa 
sinh trưởng tăng lên thì tỷ lệ tái sinh chồi và số 
chồi tạo ra có xu hướng tăng dần theo chiều 
thuận, tại công thức TS3 cho kết quả cao nhất 
về tỷ lệ tái sinh chồi và số lượng chồi lần lượt 
là 71,8% và 8,5 chồi/mẫu (hình 1f, g, h). Tiếp 
tục tăng nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng 
Công nghệ sinh học & Giống cây trồng 
 31TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP THÁNG 10/2017 
như ở công thức TS4 đến TS6 thì kết quả có xu 
hướng tăng nghịch, có nghĩa là nồng độ chất 
điều hòa sinh trưởng tăng nên nhưng tỷ lệ mẫu 
tái sinh chồi và số lượng chồi tạo ra lại có xu 
hướng giảm đi. Cụ thể là ở công thức TS6 bổ 
sung các chất điều hòa sinh trưởng thực vật có 
nồng độ cao nhất thì tỷ lệ tạo chồi và số chồi 
trung bình của một mẫu cũng có giá trị thấp 
nhất (trừ công thức đối chứng) đạt lần lượt là 
41,1% và 5,7. Như vậy, trong phạm vi nghiên 
cứu này đã chọn được công thức TS3, có thành 
phần môi trường khoáng cơ bản là MS bổ sung 
0,6 mg/l BAP, 0,1 mg/l Kinetin, 0,3 mg/l 
NAA, 100 ml/l nước dừa, 20 g/l sucrose, 7 g/l 
agar là công thức môi trường phù hợp cho tái 
sinh chồi từ mô sẹo có nguồn gốc là đoạn thân 
mầm. Kết quả phân tích phương sai cũng cho 
thấy Ftính > F0,05, chứng tỏ nồng độ các chất 
điều hòa sinh trưởng khác nhau có ảnh hưởng 
rõ rệt đến khả năng tái sinh chồi. 
3.3.2. Tái sinh chồi từ mô sẹo tạo ra từ mảnh 
lá mầm 
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp 
các chất điều hòa sinh trưởng BAP, Kinetin và 
NAA có nồng độ khác nhau đến sự tái sinh 
chồi từ mẫu mô sẹo có nguồn từ mảnh lá mầm 
sau 4 tuần nuôi cấy được thể hiện trong bảng 4. 
Từ kết quả bảng 4 cho thấy tỷ lệ tái sinh và 
số chồi trung bình trên một mẫu của các công 
thức có bổ sung BAP, Kinetin và NAA đều lớn 
hơn công thức đối chứng (ĐC) không bổ sung 
chất điều hòa sinh trưởng cho tỷ lệ tái sinh thấp 
(18,9%). Ở các công thức thí nghiệm có bổ 
sung các chất điều hòa sinh trưởng có nồng độ 
khác nhau theo quy luật tăng dần, cho kết quả 
thể hiện sự khác biệt và chia thành hai pha rõ 
ràng. Từ công thức TS1 đến TS4, khi tăng nồng 
độ chất điều hòa sinh trưởng thì các giá trị về 
tỷ lệ sống cũng như số chồi tăng theo. Tuy 
nhiên, khi tiếp tục tăng nồng độ các chất điều 
hòa sinh trưởng (TS5 - TS6) thì kết quả lại có 
chiều hướng ngược lại (tỷ lệ nghịch). Ở công 
thức TS4 cho kết quả tốt nhất về tỷ lệ mẫu tái 
sinh chồi cũng như số chồi trung bình của mẫu 
đạt lần lượt là 67,8% và 8,3 chồi/mẫu (hình 1i). 
Như vậy, công thức thí nghiệm TS4 có thành 
phần là môi trường khoáng cơ bản MS bổ sung 
0,8 mg/l BAP, 0,2 mg/l Kinetin, 0,4 mg/l 
NAA, 100 ml/l nước dừa, 20 g/l sucrose, 7 g/l 
agar là công thức môi trường phù hợp cho giai 
đoạn tái sinh chồi từ mô sẹo có nguồn gốc là 
mảnh lá mầm. Kết quả phân tích phương sai 
cũng cho thấy Ftính > F0,05, chứng tỏ, chất điều 
hòa sinh trưởng khác nhau có ảnh hưởng rõ rệt 
đến khả năng tái sinh chồi. 
3.4. Kích thích ra rễ tạo cây con hoàn chỉnh 
Các chồi phát triển tốt (kích thước 2 - 2,5 
cm) được cấy chuyển lên môi trường khoáng 
cơ bản MS bổ sung 0,5 mg/l NAA, 0,2 mg/l 
IBA, 100 ml/l nước dừa, 20 g/l sucrose và 7 g/l 
agar. Nuôi trong tối 1 tuần đầu sau đó chuyển 
ra nuôi sáng 2 tuần với cường độ chiếu sáng 
2000 lux, nhiệt độ phòng nuôi 24 ± 20C, sau 4 
tuần đạt hơn 92,4% chồi ra rễ. Cây con được 
chuyển ra trồng trong bầu với ruột bầu hỗn 
hợp, phối trộn đất tầng mặt và cát theo tỷ lệ 
1:1, đạt tỉ lệ sống 89,7%. 
IV. KẾT LUẬN 
Tái sinh cây bạch đàn thông qua tái sinh đa 
chồi trực tiếp từ mô sẹo đạt một số kết quả sau: 
- Dùng dung dịch javen 6% khử trùng hạt 
trong 5 phút, 7 phút đối với mẫu cành, tỷ lệ 
mẫu sạch lần lượt là 90,6% và 33,7%; tỷ lệ nảy 
mầm lần lượt là 82,8 và 31,4%. 
- Thân mầm có tỷ lệ tạo mô sẹo là 97,8% 
trên môi trường khoáng MS bổ sung 0,4 mg/l 
NAA, 0,2 mg/l IBA, 0,2 mg/l BAP; mảnh lá 
mầm cho tỷ lệ tạo mô sẹo đạt 94,4% trên môi 
trường khoáng MS bổ sung 0,6 mg/l NAA, 0,2 
mg/l IBA, 0,3 mg/l BAP. 
- Mô sẹo có nguồn từ thân mầm cho tỷ lệ tái 
sinh chồi và số chồi trung bình lần lượt là 
71,8% và 8,5 chồi/mẫu trên môi trường khoáng 
MS bổ sung 0,6 mg/l BAP, 0,1 mg/l Kinetin, 
Công nghệ sinh học & Giống cây trồng 
 32 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP THÁNG 10/2017 
0,3 mg/l NAA. Vật liệu mô sẹo từ mảnh lá 
mầm nuôi cấy trên môi trường khoáng MS bổ 
sung 0,8 mg/l BAP, 0,2 mg/l Kinetin, 0,4 mg/l 
NAA cho tỷ lệ tái sinh chồi đạt 67,8%, số chồi 
trung bình/mẫu đạt 8,3. 
- Chồi hữu hiệu được nuôi cấy trên môi 
trường khoáng cơ bản MS bổ sung 0,5 
mg/lNAA, 0,2 mg/l IBA, 100 ml/l nước dừa, 
20 g/l sucrose và 7 g/l agar, tỷ lệ ra rễ đạt 
92,4%. 
Hình 1. Một số hình ảnh trong quy trình tái sinh cây bạch đàn Urô 
Ghi chú: a, b, c) tạo mô sẹo từ đoạn thân mầm; d, e) tạo mô sẹo từ lá mầm; f, g, h) chồi tái sinh từ mô 
sẹo có nguồn gốc từ thân mầm; i) chồi tái sinh từ mô sẹo có nguồn gốc mảnh lá mầm. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Thành Hải, Nguyễn 
Đức Huy, Lương Ngọc Thuận (2007). Sự phát sinh phôi 
của các tế bào sinh dưỡng thực vật. Tạp chí Công nghệ 
Sinh học 5.2: 133-149. 
2. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thi Muội (1997). 
Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến giống cây 
trồng. NXB. Nông nghiệp Hà Nội: 62-104. 
3. Lê Hồng Giang, Nguyễn Bảo Toàn (2010). Tạo 
mô sẹo và tái sinh chồi từ mô lá non cây Bí kỳ nam 
(Hydnophytum formicarum Jack.). Tạp chí Khoa học – 
Trường Đại học Cần Thơ, 16a 216-222. 
4. Alves, ECSC, Xavier A., Otoni WC. (2004). 
Organogênese de explante foliar de clones 
de Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla. Pesq 
Agrop Brasil, 39(5): 421-430. 
5. Bandyopadhyay S., Cane K, Rasmussen G., 
Hamill J.D. (1999). Efficient plant regeneration from 
Công nghệ sinh học & Giống cây trồng 
 33TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP THÁNG 10/2017 
seedling explants of two commercially important 
temperate eucalypt species – Eucalyptus nitens and E. 
globules. Plant Science, 140: 189-198. 
6. Cid LPB., Machado ACMG., Carvalheira SBRC., 
Brasileiro ACM. (1999). Plant regeneration from 
seedling explants of E. grandis x E. urophylla. Plant 
Cell, Tissue and Organ Culture, 56: 17-23. 
7. Dibax R., Deschamps C., Bespalhok Filho J. C., 
Vieira LGE., Molinari HBC., De Campos MKF. And 
Quoirin M. (2010). Organogenesis and Agrobacterium 
tumefaciens- mediated transformation of Eucalyptus 
saligna with P5CS gene. Biologia Plantanrum, 54: 6-12. 
8. Dibax R., C. L. Eisfeld, F. L. Cuquel, H. Koehler 
and M. Quoirin. (2005). Plant regeneration from 
cotyledonary explants of Eucalyptus camaldulensis. 
Scientia Agricola (Piracicaba, Brazil), 62: 406-412. 
9. FAO (Food and Agriculture Organization) (2000). 
Global Forest Resource Assessment 2000. FAO Forestry 
Paper No. 140. Rome. 
10. Hajari E., Watt M. P., Mycock D. J., McAlister B. 
(2006). Plant regeneration from induced callus of improved 
Eucalyptus clones. S. Afr. J. Bot., 72: 195-201. 
11. Huang Z. C., Zeng F. H., Lu X. Y. (2010). 
Efficient regeneration of Eucalyptus urophylla from 
seedling-derived hypocotyls. Biologia Plantarum, 54: 
131-134. 
AN EFFICIENT REGENERATION SYSTEM THROUGH CALLUS OF 
EUCALYPTUS UROPHYLLA S. T. BLAKE FOR CELL LINES SELECTION 
 Nguyen Thi Huong1, Nguyen Van Viet2 
1,2Vietnam National University of Forestry 
SUMMARY 
Hypocotyls of 8 - 10 day seedling were used as explants to establish a regeneration protocol for Eucalyptus 
urophylla. The explants were cultured in Murashige T. and Skoog F. (MS) medium supplemented with α-
naphthalene acetic acid (NAA) 0.4 mg/L, β-indol butyric acid (IBA) 0.2 mg/L, 6-benzylaminopurine (BAP) 0.2 
mg/L, coconut water 100 ml/L, sucrose 20 mg/L, agar 7 g/L, the ratio of callus induction was 97.8% after 4 
weeks culturing. Callus were cultured in MS medium supplemented with BAP 0.6 mg/L, Kinetin 0.1 mg/L, 
NAA 0.2 mg/L, sucrose 20 mg/L, coconut water 100 ml/L and agar 7 g/l, showed high frequency of 
adventitious buds formation (71.8%). Regenerated shoots rooted in MS medium supplemented with NAA 0.3 
mg/L, IBA 0.2 mg/L. Plantlets were then successfully transplanted to greenhouse with 92.4% survival. 
Generally, Eucalyptus urophylla regeneration protocol via multiple-shoots induction from callus could be used 
for futher studying as choosing salt tolerant lines formed by in vitro somatic mutations . 
Keywords: Eucalyptus urophylla, hypocotyls, multiple shoots, regeneration, rooted. 
Ngày nhận bài : 24/8/2017 
Ngày phản biện : 19/9/2017 
Ngày quyết định đăng : 03/10/2017 

File đính kèm:

  • pdfxay_dung_he_thong_tai_sinh_bach_dan_uro_eucalyptus_urophylla.pdf