A multiplex real-Time PCR method for differentiation of beef, buffalo meat and pork

Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh 63
A multiplex real-time PCR method for differentiation of beef, buffalo meat and pork
Tan M. Tran1∗, & Tuan N. Nguyen2
1Regional Animal Health Office No.6, Ho Chi Minh City, Vietnam
2Faculty of Animal Science and Veterinary Medicine, Nong Lam University, Ho Chi Minh City, Vietnam
ARTICLE INFO
Research Paper
Received: May 15, 2018
Revised: July 28, 2018
Accepted: August 14, 2018
Keywords
Beef
Buffalo
DNA
Multiplex real-time PCR
Pork
∗Corresponding author
Tran Minh Tan
Email: tranminhtan06@gmail.com
ABSTRACT
The objective of this study was to optimize a multiplex real-time
PCR protocol for detection of DNA of beef, buffalo meat and pork,
serving for food authenticity. The optimized concentrations were 200
nM primer and 100 nM specific probe for beef/buffalo meat, and
300 nM primer and 150 nM probe for pork. The amplification was
performed using initial denaturation at 500C for 2 min, 950C for 2
min, followed by 45 cycles of denaturation at 950C for 15 sec, and
annealing and extension at 600C for 40 sec. This protocol had high
sensitivity and specificity. The detection limit of this method was
found to be 0.1% in raw and heat-treated meat mix (80 - 1210C/15
min) or 0.005 ng DNA/reaction. The protocol of testing was applied
for the commercial products both fresh and processed meats. The
results demonstrated that 50% of raw beef sample (6/12) weren’t
found beef DNA. Eight of twelve beef sausage samples (66.67%)
contained buffalo DNA. Beef DNA were found in all 12 samples
of beef meatballs, but eight out of the 12 meatball samples were
confirmed to have buffalo DNA (66.67%) and two out of the 12
meatball samples (16.67%) also contained porcine DNA.
Cited as: Tran, T. M., & Nguyen, T. N. (2019). A multiplex real-time PCR method for dif-
ferentiation of beef, buffalo meat and pork. The Journal of Agriculture and Development 18(1),
63-71.
www.jad.hcmuaf.edu.vn Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển 18(1)
64 Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh
Phân biệt thịt bò, trâu, heo bằng kỹ thuật multiplex real-time PCR
Trần Minh Tấn1∗ & Nguyễn Ngọc Tuân2
1Chi Cục Thú Y Vùng VI, TP. Hồ Chí Minh
2Khoa Chăn Nuôi Thú Y, Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, TP. Hồ Chí Minh
THÔNG TIN BÀI BÁO
Bài báo khoa học
Ngày nhận: 15/05/2018
Ngày chỉnh sửa: 28/07/2018
Ngày chấp nhận: 14/08/2018
Từ khóa
Bò
DNA
Heo
Multiplex real-time PCR
Trâu
∗Tác giả liên hệ
Trần Minh Tấn
Email: tranminhtan06@gmail.com
TÓM TẮT
Mục tiêu của bài báo là tối ưu quy trình multiplex real-time PCR
nhận diện DNA bò, trâu, heo, từ đó ứng dụng quy trình để phân biệt
nhanh, chính xác loại thịt và sản phẩm chế biến từ thịt bò, heo, trâu
trong gian lận thượng mại. Quy trình tối ưu có nồng độ mồi 200 nM
và đoạn dò 100 nM (bò và trâu), nồng độ mồi 300 nM và đoạn dò
150 nM (heo); chu trình nhiệt 500C/2 phút, 950C/2 phút, 45 chu kỳ
gồm biến tính ở 950C/15 giây và bắt cặp - kéo dài ở 600C/40 giây.
Quy trình có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, giới hạn phát hiện của
phương pháp đối với hỗn hợp mẫu thịt tươi và thịt đã xử lý nhiệt (80
- 1200C/15 phút) là 0,1% theo khối lượng hoặc 0,005 ng DNA/phản
ứng. Áp dụng quy trình để kiểm tra thịt tươi và sản phẩm thịt chế
biến trên thị trường đã phát hiện sự gian lận. Kết quả nghiên cứu
sơ bộ cho thấy 50% (6/12) mẫu thịt bò tươi không phát hiện được
DNA bò. Có 66,67% (8/12) mẫu xúc xích bò chứa thịt trâu trong
sản phẩm. Tất cả 12 mẫu bò viên được kiểm tra đều phát hiện có
chứa DNA bò, nhưng 66,67% mẫu lẫn thịt trâu và 16,67% mẫu lẫn
thịt heo.
1. Đặt Vấn Đề
Việc xác định loài trong sản phẩm thịt là một
lĩnh vực được phát triển nhanh chóng do có liên
quan đến sức khỏe người tiêu dùng, tôn giáo và
gian lận thương mại. Trên thị trường, nhiều sản
phẩm thịt tươi và sản phẩm thịt chế biến không
ghi đúng nhãn hiệu, thành phần các loại thịt để
gian lận, lừa dối người tiêu dùng nhằm thu lợi bất
chính. Người Ai Cập và một số người ở châu Âu
thích sử dụng thịt trâu để thay thế thịt bò do lo sợ
bệnh bò điên - BSE (Sakaridis & ctv., 2013). Việt
Nam cũng như một số nước không cho phép nhập
bột thịt xương có nguồn gốc từ bò ở các nước và
vùng lãnh thổ có bệnh BSE để làm nguyên liệu
cho thức ăn gia súc. Một số các báo cáo đã cho
thấy có sự gian lận trong thương mại gây ảnh
hưởng đến chất lượng sản phẩm cũng như sức
khỏe người tiêu dùng. Theo Ayaz & ctv. (2006),
khoảng 22% thịt và sản phẩm thịt chế biến ở Thổ
Nhĩ Kỳ chứa loại thịt không được ghi trên nhãn.
Ở Trung Quốc, cảnh sát đã thu giữ hơn 20 tấn
thịt bò giả làm từ thịt heo được xử lý với hóa chất
(Jeanette, 2013). Tháng 02/2016, Chi cục Thú y
TP. Hồ Chí Minh đã bắt quả tang một công ty
ngâm thịt heo nái với hóa chất và huyết bò để
làm giả thịt bò (Hoang, 2016). Tháng 07/2016,
Trung tâm giám định pháp y (Sở Y tế TP.HCM)
thông báo kết quả giám định bò viên của một
công ty (quận Bình Tân) cho thấy mẫu bò viên
nhãn hiệu GoGo chỉ có DNA cá, không tìm thấy
DNA bò và mẫu bò viên nhãn hiệu Merlion chỉ có
DNA trâu và cá không có DNA bò (NCVTV24,
2016). Như vậy, thịt bò và sản phẩm từ thịt bò
có giá trị kinh tế cao đã bị làm giả từ thịt trâu,
thịt heo.
Ngày nay, có nhiều phương pháp phân biệt các
loại thịt và sản phẩm chế biến từ thịt. Phương
pháp phát hiện dựa vào protein như điện di, miễn
dịch, sắc ký. Nhược điểm của phương pháp này
lại cho kết quả chậm hoặc không thể áp dụng
với sản phẩm thịt đã xử lý nhiệt độ cao. Phương
Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển 18(1) www.jad.hcmuaf.edu.vn
Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh 65
pháp dựa vào DNA như khuếch đại ngẫu nhiên
đa hình DNA-RAPD (Random Amplified Poly-
morphic DNA), PCR đặc trưng cho loài (species-
specific PCR) thường được sử dụng nhiều hơn để
xác định loài như thịt bò (Mane & ctv., 2012),
thịt trâu (Girish & ctv., 2013), thịt heo (Erwanto
& ctv., 2014). Tuy nhiên, các phương pháp này
chủ yếu phát hiện một loài duy nhất, và đoạn
DNA mục tiêu kích thước lớn nên dễ bị hư hỏng
bởi nhiệt khi chế biến. Hậu quả là làm cho các kỹ
thuật này ít tin cậy và đắt tiền hơn (Ali & ctv.,
2015).
Với sự phát triển của sinh học phân tử, kỹ
thuật này cho phép phát hiện nhiều gene đích
của nhiều loài khác nhau trong cùng một sản
phẩm thịt, đồng thời tăng độ tin cậy của phản
ứng do sử dụng các đoạn dò (probe) đặc hiệu
và rút ngắn thời gian thu kết quả (Ali & ctv.,
2014) Tuy nhiên, đến thời điểm hiện tại, chưa
có nhiều công trình ứng dụng multiplex real-time
PCR phát hiện cùng lúc thịt bò, trâu, heo từ thịt
tươi hoặc sản phẩm thịt chế biến. Đây là ba loại
thịt mà người tiêu dùng khó phân biệt về mặt
cảm quan, người sản xuất có thể giả nhãn hiệu
và thành phần của sản phẩm. Vì vậy, mục tiêu
của bài báo là tối ưu quy trình phân biệt thịt
bò, trâu, heo trong cùng một phản ứng multiplex
real-time PCR nhằm phân biệt nhanh và chính
xác loại thịt và sản phẩm chế biến từ thịt bò, heo,
trâu khi chứng minh gian lận thượng mại; kiểm
soát thức ăn gia súc có thành phần bò từ vùng
bị bệnh bò điên nhập khẩu vào Việt Nam.
2. Vật Liệu và Phương Pháp Nghiên Cứu
2.1. Chuẩn bị mẫu
Hai mươi bốn mẫu thịt tươi (bò, heo, trâu)
được thu thập từ một số lò mổ và mẫu thịt kiểm
dịch nhập khẩu ở TP. Hồ Chí Minh. Mẫu được
bảo quản lạnh đông -200C đến khi tiến hành thử
nghiệm. Mỗi mẫu thịt tươi được lấy khoảng 100
g cho vào túi nylon sạch, dán nhãn riêng. Ba
mươi mẫu thịt từ 15 loài động vật và thủy sản
khác được thu thập để kiểm tra độ nhạy, độ đặc
hiệu (02 mẫu mỗi loài). Bao gồm nhóm thú ăn
cỏ (cừu, dê, ngựa), nhóm gia cầm (gà, cút, vịt,
ngan), nhóm thú ăn thịt (chó, mèo), nhóm thú
gậm nhấm (thỏ, chuột) và nhóm hải sản (tôm,
cá). Ngoài ra, đậu nành cũng được kiểm tra đánh
giá độ nhạy, độ đặc hiệu vì đây là thành phần
thường được thêm vào trong chế biến xúc xích
thịt. Khảo sát còn thu thập 12 mẫu thịt bò tươi
tại các thớt thịt lẻ; xúc xích bò (12 mẫu) và bò
viên (12 mẫu) từ siêu thị, cửa hàng thực phẩm
tại TP.HCM để kiểm tra thành phần thịt ghi trên
nhãn sản phẩm.
2.2. Chiết tách DNA
25 mg sản phẩm cho mỗi mẫu được tách chiết
DNA bằng bộ kít DNeasy blood and tissue (Qia-
gen, Đức Cat.No 69606). Độ tinh sạch DNA được
kiểm tra bằng cách đo mật độ quang (OD) ở bước
sóng 260 nm và 280 nm bằng máy quang phổ
(Nanodrop 2000). Mẫu DNA tách chiết được tinh
sạch khi có tỷ số OD260/OD280 đạt từ 1,8 - 2,0.
Nồng độ DNA tổng số (ng/µL) được ước lượng
theo công thức: OD260 × 50 × độ pha loãng.
2.3. Đoạn mồi và đoạn dò
Trình tự đoạn mồi và đoạn dò theo Bảng 1.
2.4. Quy trình multiplex real-time PCR
Mỗi ống phản ứng 25 µl PCR chứa mastermix
5 µL DNA, nồng độ mồi theo Bảng 1. Sử dụng
bộ kít Platinumr Quantitative PCR SuperMix-
UDG(Invitrogen, Cat.No 11730-017). Phản ứng
real-time PCR được thực hiện bằng máy Agilent
Stratagene Mx 3005P Systems, ở 500C/2 phút,
950C/2 phút, 45 chu kỳ biến tính tại 950C/15
giây và bắt cặp - kéo dài ở 600C/40 giây.
Tối ưu hóa phản ứng simplex để khẳng định
nồng độ mồi thích hợp cho mỗi loài và điều kiện
phòng thí nghiệm. DNA mỗi loài được pha loãng
bậc 10 từ mẫu gốc để chạy đường chuẩn. Có hai
thông số thể hiện tính ổn định của đường chuẩn
(Pham, 2009). Thông số đầu tiên là hệ số tương
quan R2. Trị số R2 phải đạt trên hoặc bằng (≥)
0,99. Có nghĩa là đường biểu diễn chuẩn phải đạt
độ tuyến tính cao. Thông số thứ hai là hiệu quả
PCR được gọi là E% (PCR efficiency). PCR đạt
hiệu quả lý tưởng khi sau mỗi chu kỳ cường độ
huỳnh quang trong một ống phản ứng tăng gấp
đôi. Hai ống phản ứng có số lượng DNA đích ban
đầu cách nhau hệ số pha loãng A, thì hai đường
biểu diễn khuếch đại sẽ cách nhau n chu kỳ với
cường độ huỳnh quang của hai ống sẽ cách nhau
một hệ số pha loãng A = 2n. Hiệu quả PCR chấp
nhận khi E% khoảng 90% đến 110%. Với công
thức E% = (E - 1) × 100%; E = 10- 1/slope, trong
đó với slope là độ dốc đường chuẩn. Đường biểu
diễn chuẩn lý tưởng khi slope bằng -3,32. Độ dốc
này được phép dao động khoảng -3,58 đến -3,1.
www.jad.hcmuaf.edu.vn Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển 18(1)
66 Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh
B
ả
n
g
1
.
T
rìn
h
tự
đ
o
ạ
n
m
ồ
i
và
đ
o
ạ
n
d
ò
K
ý
hiệu
m
ồi
T
rình
tự
m
ồi
(5’–
3’)
N
ồng
độ
(nM
)
T
ham
khảo
M
ồi
xuôi
bò
F
A
G
T
T
A
G
A
G
A
T
T
G
A
G
A
G
C
C
A
T
A
T
A
C
T
C
T
C
C
200
K
oppel
&
ctv.,
2010
M
ồi
ngược
bò
R
T
T
G
A
T
A
A
G
A
T
C
A
T
T
G
T
C
A
G
T
C
A
T
G
T
T
G
200
Đ
oạn
dò
bò
P
FA
M
-T
G
G
T
G
A
C
A
T
G
C
C
G
C
A
A
C
T
A
G
A
C
A
C
G
-B
H
Q
1
100
M
ồi
xuôi
heo
F
C
G
A
G
A
G
G
C
T
G
C
C
G
T
A
A
A
G
G
300
K
oppel
&
ctv.,
2008
M
ồi
ngược
heo
R
T
G
C
A
A
G
G
A
A
C
A
C
G
G
C
T
A
A
G
T
G
300
Đ
oạn
dò
heo
P
H
E
X
-T
C
T
G
A
C
G
T
G
A
C
T
C
C
C
C
G
A
C
C
T
G
G
-B
H
Q
2
150
M
ồi
xuôi
trâu
F
T
C
T
G
G
G
G
A
G
G
A
T
T
C
T
C
A
G
T
A
G
200
K
oppel
&
ctv.,
2013
M
ồi
ngược
trâu
F
A
A
G
T
G
C
T
G
C
G
A
T
A
A
T
G
A
A
T
G
G
200
Đ
oạn
dò
trâu
P
R
O
X
-A
G
C
A
A
C
C
C
T
C
A
C
C
C
G
A
T
T
C
T
T
C
G
C
-B
H
Q
1
100
Sau khi thực hiện real-time PCR đơn, hai tổ hợp
mastermix mỗi loài được chọn. Ba loài: bò, heo
và trâu với 2 tổ hợp mastermix đơn mỗi loài tạo
thành 8 tổ hợp master mix đa mồi để chạy real-
time PCR. Tổ hợp master mix được chọn khi có
đường khếch đại huỳnh quang xuất hiện sớm (giá
trị Ct nhỏ) và giai đoạn bình nguyên ổn định. Tổ
hợp mồi thích hợp được chọn có nồng độ theo
Bảng 1.
2.5. Độ đặc hiệu, độ nhạy
Mẫu thịt bò đối chứng dương được lấy từ nhiều
nguồn gốc khác nhau như bò ta vàng trong nước,
bò nhập khẩu từ Mỹ, Úc, Nhật,... Thịt trâu cũng
được lấy từ trâu trong nước và trâu từ Ấn Độ.
Thịt heo được lấy từ giống heo địa phương, heo
rừng, heo ngoại lai và thịt heo nhập khẩu. Mẫu
âm tính được lấy từ loài khác như mẫu thịt cừu,
dê, ngựa, gà, cút, vịt, ngan, chó, mèo, thỏ, chuột,
tôm, cá tra, cá ngừ và bột đậu nành. Độ nhạy là
tỷ lệ % dương tính bằng phương pháp chẩn đoán
trên tổng số mẫu dương tính thật sự. Độ đặc hiệu
là tỷ lệ % âm tính bằng phương pháp chẩn.
2.6. Giới hạn phát hiện (LOD)
Để xác định giới hạn phát hiện của phương
pháp, DNA tách chiết được pha loãng bậc 10 với
nồng độ giảm dần từ 10 ng/µL đến 0,0001 ng/µL.
Sau đó, phản ứng multiplex real-time PCR được
thực hiện để tìm nồng độ thấp nhất có thể phát
hiện được DNA của bò, trâu và heo.
2.7. Xử lý số liệu
Số liệu thu thập được xử lý bằng Excel.
3. Kết Quả và Thảo Luận
3.1. Tách chiết DNA
Tất cả 56 mẫu được tách chiết DNA. Nồng
độ DNA thu được từ 40,6 - 94,6 ng/µL và tỷ số
OD260/OD280 nằm trong khoảng 1,8 - 2,0. Như
vậy, DNA đã được tinh sạch tốt, sẵn sàng sử dụng
cho phản ứng real-time PCR.
3.2. Quy trình multiplex real-time PCR
Hệ số tương quan R2 đối với DNA bò là 0,992
với heo là 0,990 và trâu là 0,995 (Hình 1). Những
hệ số tương quan này hoàn toàn phù hợp với giới
Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển 18(1) www.jad.hcmuaf.edu.vn
Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh 67
hạn cho phép (R2 ≥ 0,99). Hệ số này cho thấy
các giá trị Ct tại các điểm pha loãng bậc 10 có độ
tuyến tính cao, thao tác pha loãng mẫu, thao tác
pipet hút đúng lượng thể tích cần sử dụng. Một
tiêu chí khác để đánh giá phản ứng real-time PCR
là hiệu quả phản ứng PCR (E%). Khoảng giới hạn
cho phép của E% trong khoảng 90 - 110%. Giá trị
E% đạt được trong phản ứng real-time PCR đa
mồi từ 96,2 - 104,3% (Hình 1) nằm trong giới hạn
cho phép. Mặt khác, độ dốc (slope) từ -3,417 đến
- 3,222 là phù hợp với khoảng giới hạn từ -3,58
đến -3,10.
Hình 1. Đường khuếch đại của DNA bò (a), heo (b)
và trâu (c) Đường chuẩn DNA bò, heo, trâu (d).
Độ đặc hiệu của phản ứng được đánh giá trên
mẫu thịt của 3 loài mục tiêu và những loài khác.
Tổng số mẫu thực hiện là 56 mẫu. Trong đó có 8
mẫu bò, 8 mẫu heo, 8 mẫu trâu và 30 mẫu của 15
loài khác gồm cừu, dê, ngựa, gà, cút, vịt, ngan,
chó, mèo, thỏ, chuột, tôm, cá tra, cá ngừ và 2 mẫu
đậu nành. Tín hiệu huỳnh quang màu FAM chỉ
được ghi nhận trên những mẫu có nguồn gốc từ
bò. Những mẫu có nguồn gốc từ heo, trâu và các
loài khác không ghi nhận được tín hiệu màu FAM
của bò. Tương tự, màu HEX chỉ được ghi nhận
trên những mẫu có nguồn gốc từ heo và màu ROX
chỉ được ghi nhận trên những mẫu có nguồn gốc
từ trâu. Các mẫu bò, heo, trâu đều được phát
hiện trong cùng một phản ứng multiplex real-
time và không có phản ứng chéo giữa các loài
khác nhau. Độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng
đều đạt 100% đối với bò, heo và trâu.
3.3. Giới hạn phát hiện của DNA
Giá trị Ct và độ lệch chuẩn tương đối (relative
standard deviation: RSD) được thể hiện trong
Bảng 2. Giá trị RSD biến thiên thấp cho thấy
phản ứng multiplex real-time PCR có tính ổn
định cao ở các nồng độ DNA khác nhau và ở
những lần chạy kiểm tra khác nhau. Tại nồng độ
0,005 ng/phản ứng, giá trị Ct trung bình của mẫu
DNA bò là 36,72 ± 0,240. Ct mẫu heo và trâu ở
nồng độ này lần lượt 37,75 ± 0,125 và 37,71 ±
0,100. Ở nồng độ pha loãng tiếp theo sau đó cho
kết quả âm tính với cả ba loài vì không ghi nhận
được tín hiệu huỳnh quang, RSD ở tất cả nồng
độ pha loãng này có giá trị nhỏ hơn 1,0 (0,08 -
0,886). Như vậy, giới hạn phát hiện DNA của quy
trình là 0,005 ng/phản ứng.
3.4. Ứng dụng giới hạn phát hiện trong hỗn
hợp thịt tươi và thịt xử lý nhiệt
Trong thí nghiệm này, thịt gà được sử dụng
làm nền mẫu để thêm các loại thịt bò, heo, trâu
tạo thành hỗn hợp có tỷ lệ khác nhau, giảm dần
từ 32,0% đến 0,1%. Sở dĩ thí nghiệm chọn tỷ lệ
phối trộn thấp nhất là 0,1% vì trong gian lận
thương mại nếu dưới mức tỷ lệ này sẽ không đem
lại hiệu quả kinh tế, giá thành sản phẩm giảm
không đáng kể. Kết quả ở Bảng 3 cho thấy không
có sự khác biệt lớn giá trị Ct giữa mẫu đã xử lý
nhiệt và mẫu thịt tươi. Và ở tỷ lệ 0,1% về trọng
lượng, giá trị Ct của mẫu thịt tươi và thịt đã xử
lý nhiệt nằm trong khoảng 29,02 đến 34,61. Như
vậy, bò, heo, trâu đều được phát hiện ở mức 0,1%
trọng lượng trong hỗn hợp thịt tươi và thịt xử lý
nhiệt.
3.5. Áp dụng để kiểm tra một số mẫu thịt tươi
và thịt chế biến lưu hành trên thị trường
3.5.1. Mẫu thịt tươi
Trong 12 mẫu thịt bò được kiểm tra, kết quả
nhận diện được 06 mẫu là thịt bò, 02 mẫu là thịt
trâu và 04 mẫu hiện diện vừa thịt heo và thịt
trâu (Bảng 4). Bốn mẫu này là những mẫu thịt
đã được người bán thái mỏng trước khi được thu
thập mẫu. Có lẽ người bán thịt đã pha lẫn thịt
trâu với thịt heo để tạo hương vị và màu sắc thịt
bò nhằm đánh lừa người tiêu dùng. Như vậy, một
nửa số mẫu thịt bò tươi được kiểm tra đã có gian
lận, làm giả thịt bò từ thịt heo và thịt trâu.
3.5.2. Mẫu xúc xích
Trong 12 mẫu được kiểm tra, tất cả đều phát
hiện được thành phần heo như công bố trên bao
bì của nhà sản xuất (Bảng 5). Tuy nhiên, thịt
trâu đã được phát hiện tất cả 8 mẫu của công
ty A và B. Đó là thành phần thịt mà 2 công ty
đều không công bố trong nhãn sản phẩm. Thịt
www.jad.hcmuaf.edu.vn Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển 18(1)
68 Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh
B
ả
n
g
2
.
G
iá
trị
C
t
k
h
i
p
h
a
lo
ã
n
g
b
ậ
c
1
0
D
N
A
củ
a
th
ịt
b
ò
,
h
eo
,
trâ
u
D
N
A
(ng)
B
ò
H
eo
T
râu
G
iá
trị
C
t
T
rung
bình
SD
R
SD
G
iá
trị
C
t
T
rung
bình
SD
R
SD
G
iá
trị
C
t
T
rung
bình
SD
R
SD
50
22,45
22,30
0,155
0,695
23,58
23,81
0,204
0,858
23,65
23,65
0,045
0,191
22,30
23,88
23,69
22,14
23,97
23,60
5
26,44
26,23
0,197
0,750
27,59
27,87
0,243
0,871
27,46
27,21
0,241
0,886
26,20
28,00
27,18
26,05
28,02
226,98
0,5
29,88
29,85
0,046
0,155
31,21
31,33
0,102
0,326
30,96
30,93
0,052
0,168
29,80
31,4
30,87
29,88
31,37
30,96
0,05
33,12
33,32
0,205
0,615
33,96
33,94
0,029
0,085
34,11
34,12
0,095
0,279
33,32
33,91
34,03
33,53
33,96
34,12
0,005
36,9
36,72
0,240
0,654
37,84
37,75
0,125
0,331
37,71
37,71
0,100
0,265
36,45
37,61
37,61
36,82
37,81
37,81
0,0005
-
-
-
Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển 18(1) www.jad.hcmuaf.edu.vn
Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh 69
B
ả
n
g
3
.
G
iá
tr
ị
C
t
h
ỗ
n
h
ợ
p
th
ịt
tư
ơ
i
và
th
ịt
x
ử
lý
n
h
iệ
t
T
ỷ
lệ
(%
)
B
ò
H
eo
T
râ
u
T
hị
t
tư
ơi
80
0
C
/1
5’
12
10
C
/1
5’
T
hị
t
tư
ơi
80
0
C
/1
5’
12
10
C
/1
5’
T
hị
t
tư
ơi
80
0
C
/1
5’
12
10
C
/1
5’
32
20
,1
0
21
,3
0
21
,5
9
22
,8
3
22
,5
1
22
,4
5
19
,9
8
20
,3
3
19
,5
6
10
21
,6
1
23
,5
9
22
,8
8
24
,8
6
24
,4
4
23
,6
0
22
,2
0
22
,6
8
21
,8
5
3,
2
23
,4
8
24
,9
9
24
,7
7
26
,9
3
27
,1
3
26
,5
3
23
,7
4
24
,2
9
22
,9
8
1
25
,4
5
27
,6
8
26
,9
1
29
,4
4
29
,4
9
28
,8
3
25
,5
0
27
,3
0
23
,5
1
0,
32
27
,4
29
,1
3
29
,3
8
32
,7
1
31
,0
1
30
,9
9
26
,9
2
27
,8
9
25
,7
2
0,
1
29
,0
2
31
,2
5
31
,6
0
34
,3
2
33
,9
6
34
,6
1
28
,9
9
30
,1
3
29
,1
1
B
ả
n
g
4
.
G
iá
tr
ị
C
t
m
ẫ
u
th
ịt
tư
ơ
i
lư
u
h
à
n
h
tr
ên
th
ị
tr
ư
ờ
n
g
K
ý
hi
ệu
m
ẫu
L
oà
i
H
ìn
h
th
ức
C
t
bò
C
t
he
o
C
t
tr
âu
T
1
T
hị
t
bò
T
hị
t
đã
th
ái
m
ỏn
g
-
13
,4
1
11
,4
9
T
2
T
hị
t
bò
T
hị
t
đã
th
ái
m
ỏn
g
-
14
,6
1
14
,4
7
T
3
T
hị
t
bò
T
hị
t
ng
uy
ên
m
iế
ng
15
,9
4
-
-
T
4
T
hị
t
bò
T
hị
t
ng
uy
ên
m
iế
ng
16
,6
8
-
-
T
5
T
hị
t
bò
T
hị
t
ng
uy
ên
m
iế
ng
-
-
11
,9
T
6
T
hị
t
bò
T
hị
t
ng
uy
ên
m
iế
ng
-
14
,0
1
T
7
T
hị
t
bò
T
hị
t
đã
th
ái
m
ỏn
g
-
19
,9
9
19
,5
2
T
8
T
hị
t
bò
T
hị
t
đã
th
ái
m
ỏn
g
-
18
,7
7
20
,4
T
9
T
hị
t
bò
T
hị
t
ng
uy
ên
m
iế
ng
15
,7
5
-
-
T
10
T
hị
t
bò
T
hị
t
ng
uy
ên
m
iế
ng
16
,0
9
-
-
T
11
T
hị
t
bò
T
hị
t
ng
uy
ên
m
iế
ng
16
,0
1
-
-
T
12
T
hị
t
bò
T
hị
t
ng
uy
ên
m
iế
ng
16
,7
8
-
-
www.jad.hcmuaf.edu.vn Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển 18(1)
70 Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh
Bảng 5. Giá trị Ct mẫu xúc xích trên thị trường
Kí hiệu mẫu Công ty Thành phần trên nhãn Bò Heo Trâu
X1 A Heo, gà - 21,35 19,63
X2 A Bò, heo 21,31 22,79 18,47
X3 A Heo, tôm - 17,71 16,56
X4 A Heo, tôm - 17,36 17,82
X5 B Gà, heo, đậu nành - 23,32 20,46
X6 B Gà, heo, đậu nành - 19,24 21,51
X7 B Bò, heo, gà 24,05 26,68 20,97
X8 B Bò, heo, gà 22,85 21,62 20,76
X9 C Heo, gà - 19,33 -
X10 C Heo, gà, đậu nành - 20,04 -
X11 C Bò, heo, gà, cá 18,33 22,17 -
X12 C Bò, heo, cá 19,01 23,08 -
Bảng 6. Giá trị Ct mẫu bò viên trên thị trường
Kí hiệu mẫu Công ty Thành phần trên nhãn Bò Heo Trâu
V1 A Bò, cá basa 20,33 - 18,48
V2 A Bò, cá basa 17,95 - 16,51
V3 B Bò, đậu nành 23,15 22,36 18,99
V4 B Bò, đậu nành 22,15 19,38 18,72
V5 C Bò, cá basa, gà 22,1 - -
V6 C Bò, cá basa, gà 23,46 - -
V7 D Bò, mỡ heo 20,06 24,36 17,75
V8 D Bò, mỡ heo 17,44 19,16 16,36
V9 E Bò, heo, gà 21,16 20,03 18,91
V10 E Bò, heo, gà 20,59 20,57 19,05
V11 F Bò, thịt heo 20,16 22,03 -
V12 F Bò, thịt heo 21,08 22,78 -
trâu có thể được thêm để tăng giá trị dinh dưỡng
cũng như hương vị của sản phẩm. Mặt khác, giá
trị kinh tế của trâu thấp hơn bò. Cho nên việc
thêm thịt trâu vào xúc xích bò hoặc xúc xích bò
heo để giảm giá thành sản xuất, tăng lợi nhuận.
3.5.3. Mẫu bò viên
Bò viên có giá cao hơn các loại thịt viên khác.
Thịt viên sau khi xay nhỏ, chế biến, tẩm ướp gia
vị khó có thể nhận biết được thành phần bằng
cảm quan. Mười hai (12) mẫu bò viên từ 6 công
ty được chọn để kiểm tra. Kết quả từ Bảng 6 cho
thấy tất cả 12 mẫu đều được phát hiện có thịt bò
trong sản phẩm. Tuy nhiên, hai mẫu bò viên công
ty A đã phát hiện thêm thịt trâu trong sản phẩm.
Đây là thành phần không công bố trên nhãn. Đối
với mẫu công ty B, heo và trâu là hai thành phần
không có trên nhãn nhưng được phát hiện bằng
multiplex real-time PCR. Tương tự, những mẫu
của công ty D và E đã phát hiện được thịt trâu
trong sản phẩm. Như vậy, chỉ có 04 trên 12 mẫu
đúng về thành phần bò, heo, trâu công bố trong
sản phẩm. Hai trong số 12 mẫu (16,67%) hiện
diện thêm thịt heo mà không được công bố trên
nhãn; có 8 trên 12 mẫu (66,67%) được thêm thịt
trâu vào trong sản phẩm bò viên.
4. Kết Luận
Đã tối ưu quy trình multiplex real-time PCR
phân biệt thịt bò, trâu, heo với độ đặc hiệu và độ
tin cậy cao, giới hạn phát hiện thịt tươi (bò, trâu,
heo) và thịt xử lý nhiệt (80 - 1200C/15 phút) là
0,1% theo trọng lượng trong hỗn hợp hoặc 0,005
ng DNA/phản ứng. Ứng dụng multiplex real-time
PCR để phát hiện mẫu thịt tươi nguyên miếng
hoặc thái mỏng và một số sản phẩm thịt chế biến
trên thị trường cho thấy có vấn đề gian lận giả
thịt bò từ thịt heo và thịt trâu.
Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển 18(1) www.jad.hcmuaf.edu.vn
Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh 71
Tài Liệu Tham Khảo (References)
Ali, M. E., Asing, Hamid, S. B. A., Razzak, M. A.,
Rashid, N. R. A., Al Amin, M., & Mustafa, S. (2015).
A suitable method to detect potential fraud of bring-
ing Malayan box turtle (Cuora amboinensis) meat into
the food chain. Food Additives & Contaminants, Part
A, 32(8), 1223-1233.
Ali, M. E., Razzak, M. A., & Hamid, S. B. A. (2014).
Multiplex PCR in species authentication: Probability
and prospects review. Food Analytical Methods 7(10),
1933-1949.
Ayaz, Y., Ayaz N. D., & Erol I. (2006). Detection of
species in meat and meat products using enzyme-
linked immunosorbent assay. Journal of Muscle Foods
17(2), 214-220.
Erwanto, Y., Zainal Abidin, M., Sugiyono, E. Y. P. M., &
Rohman, A. (2014). Identification of pork contamina-
tion in meatballs of Indonesia local market using poly-
merase chain reaction-restriction fragment length poly-
morphism (PCR-RFLP) analysis. Asian-Australasian
Journal of Animal Sciences 27(10), 1487–1492.
Girish, P. S., Haunshi, S., Vaithiyanathan, S., Rajitha, R.,
& Ramakrishna, C. (2013). A rapid method for authen-
tication of buffalo (Bubalus bubalis) meat by alkaline
lysis method of DNA extraction and species-specific
polymerase chain reaction. Journal of Food Science
and Technology 50(1), 141-146.
Hoang, L. (2016). All samples of fake beef orig-
inated from sow meat are contaminated with
microorganisms. The Youth Newspaper. Retrieved
February 17, 2016, from 
te/20160217/tat-ca-mau-thit-heo-nai-gia-thit-bo-deu-
nhiem-vi-sinh/1052863.html.
Jeanette, T. (2013). Chinese police seize more than
20,000 kg of fake beef. Retrieved September 20,
2013, from https://sg.news.yahoo.com/blogs/what-is-
buzzing/chinese-police-seize-more-20-000kg-fake-beef-
035448883.html.
Koppel, R., Ruf, J., & Rentsch, J. (2010). Multiplex real-
time PCR for the detection and quantification of DNA
from beef, pork, horse and sheep. European Food Re-
search and Technology 232(1), 151-155.
Koppel, R., Ruf, J., Zimmerli, F., & Breitenmoser, A.
(2008). Multiplex real-time PCR for the detection
and quantification of DNA from beef, pork, chicken
and turkey. European Food Research and Technology
227(4), 1199-1203.
Koppel, R., Weibel, S., Ruf, J., Eugster, A., Beck, K., &
Rentsch, J. (2013). Interlaboratory validation of two
multiplex quantitative real-time PCR methods to de-
termine species DNA of cow, sheep and goat as a mea-
sure of milk proportions in cheese. European Food Re-
search and Technology 236(1), 217-227.
Mane, B. G., Mendiratta, S. K., & Tiwari, A. K. (2012).
Beef specific polymerase chain reaction assay for au-
thentication of meat and meat products. Food Control
28(2), 246-249.
NCVTV24 (News Center VTV24). (2016). No beef
DNA from the 2 samples of beef meatballs of Viet
Sin is detected. Retrieved July 12, 2016, from
cua-bo-trong-2-mau-bo-vien-cua-viet-sin-201602.htm.
Pham, V. H. (2009). PCR and real-time PCR, basic prob-
lems and common applications. Ho Chi Minh City,
Vietnam: Medical Publishing House.
Sakaridis, I., Ganopoulos, I., Argiriou, A., & Tsaftaris, A.
(2013). A fast and accurate method for controlling the
correct labeling of products containing buffalo meat
using high resolution melting (HRM) analysis. Meat
Science 94(1), 84-88.
www.jad.hcmuaf.edu.vn Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển 18(1)