Sàng lọc và nghiên cứ khả năng sinh tổng hợp chitinase của các chủng Bacillus thuringiensis phân lập ở Việt Nam

Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV – Số 1/2019 
 9 
soát bệnh nấm hồng 69,51% và Copper 
oxychloride 54,27%. 
5. ĐỀ NGHỊ 
Trong mùa mưa, khi bệnh nấm hồng phát 
triển nhanh và gây hại nặng có thể luân phiên sử 
dụng các loại thuốc Copper hydroxide và Copper 
oxychloride trong kết quả thí nghiệm để tăng hiệu 
quả trừ bệnh, kết hợp giữa bôi thuốc và phun 
thuốc, thường xuyên cắt tỉa cành cho thông 
thoáng, loại bỏ cành vượt để giảm sự lưu tồn, lây 
lan gây hại của mầm bệnh. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. Chi cục Bảo vệ thực vật Long An, 2017. Tình 
hình gây hại của một số sâu bệnh trên cây chanh. Báo 
cáo tổng hợp dịch hại trên cây trồng. 5 trang 
2. Nene, Y.L. and Thapliyal, P.N.,1982. Fungicides 
in Plant Disease Control. Oxford and IBH Publishing 
House, New Delhi, p. 163 
3. Prashad, D., Sharma I. M., and Dhiman S., 
2015. Integrated management of pink canker 
(Corticium salmonicolor Berk.&Br.) in apple. J.Mycol. 
Plant Pathol, 45 (1): 22-29 
4. Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Long 
An, 2017. Báo cáo thực hiện nhiệm vụ tổng kết ngành 
năm 2017. 15 trang 
5. Vincent, J. M., 1927. Distortion of fungal hyphae 
in the presence of certain inhibitore. Nature 159, p. 180 
Phản biện: TS. Đinh Văn Đức 
SÀNG LỌC VÀ NGHIÊN CỨ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CHITINASE 
 CỦA CÁC CHỦNG Bacillus thuringiensis PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM 
Isolation and Optimization Study Ofantifungal Chitinase Biosynthesis of 
Bacillus thuringiensis Strains Isolated in Viet Nam 
Trịnh Thị Thu Hà, Lê Thị Minh Thành, Lê Văn Trƣờng, Mẫn Hồng Phƣớc, 
Hoàng Thị Hồng Anh và Đồng Văn Quyền 
Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH và CN Việt Nam 
Ngày nhận bài: 04.12.2018 Ngày chấp nhận: 28.12.2018 
Abstract 
It has long been known that Bacillus thuringiensis (Bt) was successfully used for the control of insect pests. In 
addition, a research on the ability to produce abundant chitinolytic enzymes (chitinase) of Bt have been done. 
Chitinase produced by Bt can be applied in agriculture to control of fungal pathogens. In this study, 452 Bt strains 
isolated in the Northeast of Vietnam were screened for chitinase-producing strains, resulting in 107 strains 
(making up 23.67%). In 31 strains with the high chitinase activity, 22 strains (accounting for 70.97%) were 
selected and screened for genes encoding chitinase protein; they are studied about culture conditions which is 
influent to chitinase activity. The factors for chitinase biosynthesis of selected strain were optimized, including: 
substrate source as chitin at 0.5% concentration; Carbon source as corn flour; Nitrogen source: soybean meal; 
Medium pH at 7 and culture temperature at 28
o
C. In other hands, five strains releasing toxicity against pathogenic 
fungi F. oxysporum and R. solani were screened from 31 strains with antifugal ring diameters in the range 5 -13 
mm. These strains will be a source of raw materials for research to develop bioproducts that use to control both 
insects and plant diseases in crops. 
Keywords: Bacillus thuringiensis, chiA, chitinase, culture conditions, antifungal. 
Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV – Số 1/2019 
 10 
1. ĐẶT VẤN ĐỀ 
Nguồn gen vi sinh vật nói chung, nguồn gen 
vi khuẩn Bt nói riêng có vai trò quan trọng trong 
chiến lược phát triển công nghệ sinh học. Vi 
khuẩn Bt được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh 
vực: nông - lâm nghiệp như sản xuất thuốc trừ 
sâu sinh học, tạo giống cây trồng biến đổi gen 
có khả năng kháng sâu bệnh [3 ; trong y tế như 
kiểm soát muỗi - vectơ truyền nhiều bệnh nguy 
hiểm (sốt rét, sốt xuất huyết, viêm não Nhật 
Bản, bệnh giun chỉ, bệnh sùi chân voi); môi 
trường (diệt ruồi tại các trang trại chăn nuôi gia 
súc, gia cầm) 
Bên cạnh việc sản sinh protein độc tố diệt côn 
trùng, trong quá trình sinh trưởng phát triển vi 
khuẩn Bt còn sản sinh một số chất chuyển hóa 
(trong đó có chitinase) và được xem là đối tượng 
có khả năng sinh chitinase rất phong phú. 
Chitinase có vai trò quan trọng trong đời sống 
c ng như trong nghiên cứu khoa học. Hiện nay, 
chitinase được ứng dụng chủ yếu trong sản xuất 
chitooligosaccharide, nano-chitin, N-acetyl D-
glucosamine.... là những sản phẩm có giá trị kinh 
tế và ứng dụng cao, an toàn đối với con người, 
môi trường và được sử dụng trong nông nghiệp, 
thực phẩm và y dược. Ngoài ra, chitinase còn 
được sử dụng như thuốc trừ sâu sinh học trong 
nông nghiệp nhờ khả năng phân hủy cấu trúc 
chitin trong thành tế bào của nấm gây bệnh và 
côn trùng. Chitinase từ Bt có hiệu quả hơn 
chitinase từ B. licheniformis trong việc làm tăng tỉ 
lệ nảy mầm của hạt đậu lây nhiễm nấm gây bệnh 
[4 . Các nhà khoa học Trung Quốc đã phân lập 
gen chiA mã hóa chitinase họ 18 từ chủng B. 
thuringiensis YBT-9602, rồi gây đột biến gen 
ChiW50A, ChiW50A đột biến có tác động cộng 
hưởng đáng kể với các chế phẩm bào tử - tinh 
thể của Bt chống lại ấu trùng loài Helicoverpa 
armigera (thuộc Bộ cánh vẩy) và Caenorhabditis 
elegans (bộ Giun tròn) và ức chế sự phát triển 
một số nấm gây bệnh thực vật [5 . Gen chiA mã 
hóa endochitinase của chủng B. thuringiensis 
subsp. tenebrionis DSM- 2803 đã được tạo dòng 
và biểu hiện trong E. coli, enzym tái tổ hợp có tác 
dụng làm giảm sự tăng trưởng của nấm 
Colletotrichium gloeosporioides – tác nhân gây 
bệnh thán thư ở thực vật [2 . 
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành 
sàng lọc, tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bt phân 
lập ở Việt Nam có khả năng sinh chitinase cao 
nhằm cung cấp nguồn nguyên liệu phục vụ cho 
các nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học Bt mới có 
tác dụng kép trong phòng trừ sâu - bệnh hại cây 
trồng hướng tới xây dựng một nền nông nghiệp 
sạch, bền vững tại Việt Nam. 
2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 
2.1 Vật liệu 
Các chủng vi khuẩn Bt phân lập ở khu vực 
Đông Bắc Bộ Việt Nam trong bộ sưu tập Bt Việt 
Nam. Hai chủng vi nấm gây bệnh thực vật F. 
oxysporum và R. solani do Bộ môn Vi sinh –Học 
viện Nông nghiệp cung cấp. 
Hóa chất: Chitin powder (Sigma), dung dịch 
Lugol 1%, N-acetyl D-glucosamine(Sigma), cao 
nấm men (Merk), peptone (Merk)...Thang DNA 
chuẩn (Thermo scientific, kích thước 10 kb). Cặp 
mồi chiF và chiR có trình tự sau: 
chiF ATAGAATTCATGGCTATGAGGTCTCAAAAA 
chiR ATCTCGAGGTTTTCGCTAATGACGGCATT. 
2.2 Phƣơng pháp 
2.1.1. Sàng lọc hoạt tính thủy phân chitin 
Hoạt tính thủy phân chitin được định tính 
theo phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. 
Đĩa thạch chứa cơ chất chitin huyền phù 0,5% 
được đục lỗ đường kính 0,8 cm. Mỗi giếng nhỏ 
100µl dịch enzym thô rồi để 2-3 tiếng ở 4ºC để 
enzym khuếch tán vào thạch. Sau đó chuyển 
đĩa vào ủ 37ºC, trong 14 – 16 giờ rồi lấy ra 
nhuộm bằng dung dịch 1% lugol. Đường kính 
vòng thủy phân được xác định bằng D – d (D: 
đường kính vòng ngoài vùng không bắt màu 
thuốc nhuộm, d: đường kính lỗ), thể hiện hoạt 
tính tương đối của enzym. 
2.1.2. Xác định hoạt tính chitinase 
Phản ứng gồm 0,5 ml dung dịch chitinase và 
0,5 ml chitin huyền phù 1%, ủ ở 55
ο
C trong 60 
phút. Dừng phản ứng bằng cách đun cách thủy 
hỗn hợp trong 5 phút. Sau đó, ly tâm tốc độ 
10.000 vòng/phút trong 5 phút rồi thu dịch. 
Lượng N-acetyl D-glucosamine được xác định 
dựa vào đồ thị chuẩn biểu diễn sự tương quan 
tuyến tính giữa hàm lượng N-acetyl D-
Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV – Số 1/2019 
 11 
glucosamine và giá trị OD (Hình 1). Một đơn vị 
hoạt độ chitinase được xác định là lượng 
enzyme cần thiết để giải phóng ra 1 µmol N-
acetyl D-glucosamine trong thời gian 1 phút ở 
40
o
C và pH = 7. 
Hình 1. Đồ thị chuẩn xác định hàm lƣ ng N-acetyl D-glucosamine theo phƣơng pháp Miller 
2.1.3. Phương pháp PCR nhân gen chiA 
PCR nhân đoạn mã hóa gen chiA được thực 
hiện trong hỗn hợp các thành phần gồm: 2 µl 
dNTPs; 2 µl buffer; 1 µl mồi xuôi (10 pmol/µl); 1 µl 
mồi ngược (10 pmol/µl); 1 µl glycerol; 1 µl DMSO; 
0,3 µl Taq polymerase; 2 µl DNA; 9,7 µl nước cất 
đã loại ion và khử trùng, tổng thể tích 20 µl. Quá 
trình PCR được thực hiện theo chu trình nhiệt: 
biến tính: 94ºC trong 2 phút, biến tính 94ºC trong 
30 giây, gắn mồi: 60ºC trong 30 giây, kéo dài 72ºC 
trong 1 phút 30 giây, lặp lại 30 chu kỳ từ bước 2, 
kéo dài ở 72ºC trong 10 phút và kết thúc ở 4ºC. 
Sử dụng cặp mồi đặc hiệu chiF và chiR cho phản 
ứng nhân gen chiA. 
2.1.4. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy chủng Bt 
sinh tổng hợp chitinase 
Điều kiện nuôi cấy các chủng Bt sinh tổng 
hợp chitinase (nguồn cơ chất, nồng độ cơ chất, 
nguồn các bon và ni tơ, pH môi trường, nhiệt độ 
nuôi cấy) được khảo sát lần lượt qua 6 thí 
nghiệm. Yếu tố khảo sát của thí nghiệm trước 
được dùng ngay cho thí nghiệm tiếp theo. 
Nguồn cơ chất: Môi trường MTCS với pH= 7 
ở nhiệt độ 28ºC, bổ sung bột chitin (Sigma) đã 
được thủy phân thành dạng chitin huyền phù, 
chitin thô dạng vảy từ vỏ tôm, vỏ cua với nồng độ 
1%. Sau 96 giờ nuôi, thu dịch thô để xác định 
hoạt tính. 
Nồng độ cơ chất: Môi trường MTCS với pH= 
7 ở nhiệt độ 28ºC, bổ sung chitin huyền phù ở 
các nồng độ: 0; 0,5; 1 và 1,5. Sau 96 giờ nuôi, 
thu dịch enzym thô để xác định hoạt tính. 
Nguồn các bon: Môi trường MTCS, với pH= 7 
ở nhiệt độ 28ºC, bổ sung chitin huyền phù nồng 
độ 0,5%. Nguồn các bon: glucose, sacharose và 
bột ngô. Sau 96 giờ nuôi, thu dịch thô để xác định 
hoạt tính enzym. 
Nguồn ni tơ: Môi trường MTCS (glucose được 
thay bằng bột ngô), với pH= 7 ở nhiệt độ 28ºC, 
bổ sung chitin huyền phù nồng độ 0,5%. Cao 
nấm men được thay thế bằng các nguồn ni tơ 
khác: bột đậu tương, cao thịt và urê. 
pH môi trường: Môi trường MTCS, với nhiệt 
độ 28ºC, bổ sung chitin huyền phù 0,5%, pH môi 
trường là 6, 7 và 8. Sau 96 giờ nuôi, thu dịch 
enzym thô để xác định hoạt tính 
Nhiệt độ nuôi cấy: Môi trường MTCS, pH7, bổ 
sung chitin huyền phù 0,5%, nuôi lắc ở các nhiệt 
độ: 20, 28 và 37ºC. Dịch enzym thô được thu sau 
96 giờ nuôi để xác định hoạt tính. 
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 
3.1 Sàng lọc hoạt tính thủy phân chitin của 
các chủng Bt phân lập 
Từ 452 chủng vi khuẩn Bt phân lập ở các địa 
phương thuộc khu vực Đông Bắc Bộ, tiến hành 
sàng lọc khả năng sinh enzym thủy phân chitin 
trên môi trường thạch có bổ sung chitin. Kết quả 
thu được 107 chủng có khả năng thủy phân 
chitin (bảng 1). Trong đó, 31 chủng có đường 
kính vòng thủy phân lớn (từ 20 – 30 mm), số 
chủng có khả năng sinh chitinase chiếm tỉ lệ 
23,67%; đây s là nguồn nguyên liệu dồi dào cho 
khai thác và ứng dụng sản xuất chitinase. Kết 
quả này là phù hợp so với kết quả nghiên cứu 
của Shivalee [7 , đường kính vòng thủy phân 
chitin lớn nhất của các chủng vi khuẩn phân lập 
từ đất là 30 mm. 
Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV – Số 1/2019 
 12 
Bảng 1. Kết quả sàng lọc hoạt tính thủy phân 
chitin của các chủng Bt phân lập 
STT 
Đường kính vòng 
thủy phân 
(D-d: mm) 
Số chủng 
1 0 345 
2 1 – 10 42 
3 11 – 19 34 
4 20 - 29 30 
5 ≥ 30 1 
Tổng số 452 
Tiến hành xác định hoạt tính chitinase của 31 
chủng Bt nói trên và 1 chủng Bt có đường kính 
vòng phân giải nhỏ nhất (3 mm: chủng HT1.2). 
Kết quả khảo sát cho thấy, chitinase từ chủng Bt 
MSS1.1 sinh ra là cao nhất (đạt 0,54 U/ml), tiếp 
theo là chủng TQ3.3 đạt 0,53 U/ml và thấp nhất là 
chủng HT1.2 phân lập ở Hòa Bình với hoạt tính 
chỉ đạt 0,03 U/ml (hình 2). 
Trong kết quả này, hoạt tính chitinase của 
chủng Bt MSS1.1 là cao nhất, đạt 0,54 U/ml, cao 
hơn 2,3 lần so với chủng Bt được phân lập ở 
Pakistan (hoạt tính đạt 0,23 U/ml) [6]. Điều đó cho 
thấy, các chủng vi khuẩn Bt phân lập ở Việt Nam 
có tiềm năng lớn trong khai thác chitinase. 
Hình 2. Sàng lọc hoạt tính thủy phân chitin của một số chủng Bt (A) 
Hoạt tính chitinase của 13 chủng Bt hác nhau. (B) 
(1. MSS1.1; 2. HL2.3; 3. HT1.2; 4. DHG1.1; 5. ĐC) 
3.2 Phân lập, sàng lọc gen chiA 
DNA hệ gen của 31 chủng Bt có khả năng 
sinh chitinase đã được tách chiết và dùng làm 
khuôn để khuếch đại đoạn gen mã hóa protein 
ChiA bằng phương pháp PCR sử dụng cặp mồi 
đặc hiệu chiF và chiR. Kết quả cho thấy, đã 
khuếch đại được 22 đoạn gen chiA với kích 
thước khoảng 2 kb từ 22/31 chủng được lựa 
chọn (hình 3). Như vậy, số chủng mang gen chiA 
chiếm tỷ lệ tới 70,97%. Kết quả này làm cơ sở 
cho các nghiên cứu tiếp theo, đồng thời làm 
phong phú thêm cho Bộ Sưu tập nguồn gen 
chitinase của các chủng Bt Việt Nam, phục vụ 
cho nghiên cứu và ứng dụng sau này. 
Hình 3. Kết quả sàng lọc gen chiA từ các 
chủng Bt có hả năng phân giải chitin: 
M. marker; 1- 8. thứ tự các chủng MSS1.1, 
TQ3.3, TD8.12, TQL4.6, 
MSS7.6, MSS6.4, Bt 1.4, DHG1.1. 
3.3 Nghiên cứu điều iện nuôi cấy chủng 
Bt sinh tổng h p chitinase 
Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV – Số 1/2019 
 13 
3.3.1. Nguồn cơ chất 
Mỗi loài vi sinh vật thích hợp với một loại cơ 
chất chitin có nguồn gốc khác nhau, khi sử dụng 
nguồn cơ chất cảm ứng thích hợp với nồng độ 
tối ưu có thể khai thác tối đa khả năng sinh tổng 
hợp enzym thủy phân chitin của mỗi loài vi sinh 
vật. Khi sử dụng bột chitin làm cơ chất cảm ứng, 
hoạt độ chitinase do 31 chủng Bt sinh ra đều đạt 
mức độ cao hơn so với khi sử dụng cơ chất là vỏ 
tôm và vỏ cua (bảng 2). Như vậy, bột chitin là cơ 
chất thích hợp cho khả năng sinh chitinase của 
các chủng Bt đã lựa chọn. 
3.3.2. Nồng độ cơ chất 
Cơ chất chitin đóng vai trò như chất cảm ứng 
cho quá trình sinh tổng hợp enzym tương ứng. 
Khi sử dụng cơ chất chitin vào môi trường nuôi 
cấy s tác động mạnh đến sinh trưởng và sinh 
tổng hợp chitinase của 31 chủng Bt lựa chọn. 
Kết quả thể hiện ở bảng 2 cho thấy, khi không có 
mặt chitin trong môi trường nuôi cấy, các chủng 
vi khuẩn Bt vẫn sinh tổng hợp chitinase nhưng 
hoạt độ rất thấp (< 0,1 U/ml). Khi bổ sung chitin 
với nồng độ 0,5% thì hoạt tính chitinase sinh ra 
cao nhất (đạt 0,52 - 0,70 U/ml). 
Bảng 2. Hoạt độ chitinase (U/ml) của 31 chủng Bt 
 hi sử dụng nguồn cơ chất và nồng độ cơ chất hác nhau 
TT 
Kí hiệu 
chủng 
Nguồn cơ chất Nồng độ cơ chất (%) 
Bột 
chitin 
Vỏ tôm Vỏ cua 0 0,5 1 1,5 
1. DHG13.6 0,54 0,36 0,39 0,01 0,54 0,40 0,40 
2. DHG8.3 0,52 0,34 0,42 0,03 0,55 0,42 0,41 
3. DHG9.2 0,62 0,40 0,42 0,12 0,62 0,40 0,42 
4. DHG10.5 0,61 0,39 0,40 0,03 0,62 0,41 0,40 
5. MHY1.6 0,57 0,45 0,46 0,01 0,60 0,49 0,50 
6. MHY1.7 0,56 0,41 0,43 0,02 0,59 0,44 0,45 
7. MHY1.9 0,64 0,49 0,51 0,09 0,67 0,53 0,52 
8. MHY10.2 0,55 0,43 0,44 0,03 0,55 0,45 0,44 
9. MHY13.5 0,53 0,41 0,42 0,01 0,52 0,42 0,42 
10. MHY13.6 0,58 0,46 0,49 0,02 0,56 0,51 0,49 
11. MHY13.7 0,57 0,39 0,45 0,02 0,58 0,50 0,51 
12. MHY13.2 0,60 0,48 0,52 0,05 0,60 0,54 0,54 
13. TD3.18 0,57 0,41 0,50 0,01 0,59 0,50 0,50 
14. TD8.12 0,59 0,46 0,55 0,04 0,56 0,55 0,55 
15. HT2.2.6 0,58 0,48 0,48 0,11 0,60 0,49 0,48 
16. HT3.1.2 0,58 0,45 0,49 0,08 0,59 0,52 0,51 
17. HT2.2.2 0,55 0,37 0,48 0,03 0,57 0,50 0,48 
18. HT3.1.8 0,58 0,45 0,47 0,01 0,60 0,48 0,49 
19. HT3.2.5 0,59 0,44 0,50 0,00 0,59 0,52 0,51 
20. 27.6TN 0,62 0,53 0,60 0,05 0,62 0,61 0,60 
21. 11.1 TN 0,56 0,48 0,54 0,02 0,55 0,50 0,50 
22. TQ3.3 0,65 0,48 0,55 0,12 0,68 0,58 0,59 
23. TQL4.6 0,58 0,46 0,51 0,02 0,58 0,51 0,51 
24. Bt 1.4 0,60 0,47 0,50 0,02 0,61 0,51 0,50 
25. MSS1.1 0,67 0,47 0,52 0,14 0,70 0,55 0,55 
26. MSS7.6 0,56 0,42 0,56 0,03 0,59 0,56 0,56 
27. MSS6.4 0,60 0,41 0,46 0,01 0,60 0,50 0,46 
28. MSS6.3 0,59 0,50 0,52 0,01 0,61 0,54 0,53 
29. MSS8.3 0,61 0,51 0,53 0,02 0,62 0,53 0,53 
30. RH2.1 0,62 0,43 0,49 0,09 0,64 0,52 0,52 
31. HDC4.7 0,54 0,44 0,50 0,07 0,55 0,50 0,49 
Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV – Số 1/2019 
 14 
3.3.3. Nguồn các bon 
Khi glucose trong môi trường cơ sở được thay 
thế bằng các nguồn các bon khác nhau thì 
chitinase sinh ra có hoạt tính khác nhau (Bảng 3). 
Trong môi trường sử dụng bột ngô làm nguồn các 
bon chính, hoạt tính chitinase đạt cao nhất (0,62 - 
0,77 U/ml), cao hơn so với môi trường cơ sở ban 
đầu sử dụng glucose làm nguồn các bon (hoạt tính 
đạt 0,52 – 0,67 U/ml). Hoạt tính chitinase sinh ra 
thấp nhất (0,34 - 0,52 U/ml) trong môi trường có 
nguồn các bon là saccharose. Như vậy, nguồn các 
bon thích hợp nhất cho sinh tổng hợp chitinase của 
các chủng lựa chọn là bột ngô. 
3.3.4. Nguồn ni tơ 
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nguồn ni tơ 
thể hiện ở bảng 3 cho thấy, khi bột đậu tương 
được sử dụng làm nguồn ni tơ thì hoạt tính 
chitinase thu được cao nhất, đạt tới 0,62 – 0,79 
U/ml. Khi sử dụng urea làm nguồn ni tơ thì hoạt 
tính chitinase thu được thấp nhất hơn, chỉ đạt 
0,31 - 0,45 U/ml. Trong khi đó, hoạt tính chitinase 
của chủng nấm Penicillium sp. M4 đạt cao nhất 
khi môi trường được bổ sung urea [8 . Như vậy, 
có sự khác biệt về nhu cầu ni tơ giữa vi khuẩn Bt 
và nấm Penicillium. 
Bảng 3. Hoạt độ chitinase (U/ml) của 31 chủng Bt hi sử dụng nguồn các bon 
và nguồn ni tơ hác nhau 
TT 
Kí hiệu 
chủng 
Nguồn các bon Nguồn ni tơ 
Bột ngô Glucose Saccharose Bột đậu 
tương 
Urea Cao thịt 
1. DHG13.6 0,63 0,55 0,37 0,67 0,35 0,57 
2. DHG8.3 0,62 0,52 0,40 0,65 0,32 0,56 
3. DHG9.2 0,72 0,61 0,43 0,73 0,37 0,62 
4. DHG10.5 0,70 0,63 0,46 0,73 0,41 0,60 
5. MHY1.6 0,68 0,60 0,47 0,70 0,45 0,61 
6. MHY1.7 0,67 0,59 0,45 0,69 0,40 0,60 
7. MHY1.9 0,74 0,63 0,52 0,77 0,43 0,64 
8. MHY10.2 0,63 0,55 0,44 0,68 0,35 0,55 
9. MHY13.5 0,60 0,53 0,42 0,62 0,33 0,52 
10. MHY13.6 0,65 0,60 0,46 0,66 0,41 0,59 
11. MHY13.7 0,68 0,59 0,41 0,69 0,40 0,58 
12. MHY13.2 0,70 0,61 0,52 0,70 0,44 0,58 
13. TD3.18 0,67 0,59 0,50 0,69 0,40 0,55 
14. TD8.12 0,69 0,62 0,45 0,69 0,35 0,53 
15. HT2.2.6 0,68 0,59 0,46 0,70 0,39 0,58 
16. HT3.1.2 0,71 0,58 0,46 0,71 0,40 0,61 
17. HT2.2.2 0,65 0,55 0,45 0,63 0,36 0,50 
18. HT3.1.8 0,68 0,60 0,45 0,69 0,37 0,60 
19. HT3.2.5 0,69 0,60 0,50 0,68 0,35 0,61 
20. 27.6TN 0,72 0,64 0,50 0,70 0,42 0,61 
21. 11.1 TN 0,64 0,56 0,47 0,65 0,30 0,60 
22. TQ3.3 0,75 0,66 0,51 0,78 0,37 0,69 
23. TQL4.6 0,68 0,60 0,45 0,71 0,34 0,63 
24. Bt 1.4 0,70 0,61 0,47 0,71 0,31 0,50 
25. MSS1.1 0,77 0,69 0,42 0,79 0,35 0,67 
26. MSS7.6 0,65 0,56 0,41 0,66 0,36 0,56 
27. MSS6.4 0,70 0,58 0,41 0,65 0,40 0,50 
28. MSS6.3 0,67 0,59 0,34 0,71 0,42 0,58 
29. MSS8.3 0,65 0,61 0,44 0,67 0,43 0,55 
30. RH2.1 0,64 0,62 0,39 0,67 0,32 0,52 
31. HDC4.7 0,64 0,56 0,40 0,65 0,40 0,51 
Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV – Số 1/2019 
 15 
3.3.5. pH môi trường 
Mỗi loài vi sinh vật có một pH môi trường 
thích hợp cho sinh tổng hợp chitinase. Ở các 
mức pH môi trường khảo sát, hoạt tính chitinase 
đạt cao nhất tại pH= 7 đạt 0,63 - 0,78 U/ml, ở pH= 6 
và pH= 8 thì hoạt tính chitinase không có sự 
chênh lệch nhiều (bảng 4). Như vậy, pH môi 
trường thích hợp cho các chủng Bt lựa chọn sinh 
tổng hợp chitinase là 7. Đối với vi khuẩn B. 
subtilis, pH thích hợp cho sinh tổng hợp chitinase 
c ng ở mức pH= 7 [1]. 
3.3.6. Nhiệt độ thích hợp 
Khi khảo sát nhiệt độ nuôi cấy các chủng vi 
khuẩn Bt lựa chọn ở các khoảng nhiệt độ 20, 28 
và 37ºC nhận thấy ở 28ºC chitinase được tổng 
hợp mạnh nhất, hoạt tính đạt 0,62 – 0,79 U/ml), 
ở nhiệt độ 37
0
C thì hoạt tính thu được thấp nhất 
(0,36 – 0,60 U/ml) (bảng 4). Điều này hoàn toàn 
phù hợp vì 28ºC là nhiệt độ thích hợp nhất cho 
sinh trưởng và phát triển của Bt và ở 37
0
C thì sự 
hình thành bào tử tăng lên. 
Bảng 4. Hoạt độ chitinase (U/ml) của 31 chủng Bt 
 hi đƣ c nuôi cấy ở pH và nhiệt độ hác nhau 
TT 
Kí hiệu 
chủng 
pH môi trường Nhiệt độ nuôi (
0
C) 
6 7 8 20 28 37 
1. DHG13.6 0,53 0,65 0,55 0,54 0,66 0,37 
2. DHG8.3 0,51 0,66 0,53 0,54 0,68 0,36 
3. DHG9.2 0,49 0,74 0,54 0,52 0,74 0,43 
4. DHG10.5 0,55 0,74 0,61 0,60 0,73 0,51 
5. MHY1.6 0,52 0,68 0,55 0,55 0,69 0,50 
6. MHY1.7 0,53 0,71 0,58 0,60 0,71 0,48 
7. MHY1.9 0,59 0,78 0,62 0,66 0,79 0,54 
8. MHY10.2 0,50 0,66 0,54 0,55 0,67 0,45 
9. MHY13.5 0,46 0,63 0,45 0,47 0,63 0,42 
10. MHY13.6 0,48 0,64 0,48 0,49 0,66 0,37 
11. MHY13.7 0,52 0,65 0,57 0,56 0,64 0,47 
12. MHY13.2 0,54 0,72 0,58 0,60 0,72 0,44 
13. TD3.18 0,56 0,67 0,60 0,62 0,68 0,55 
14. TD8.12 0,50 0,71 0,55 0,58 0,70 0,43 
15. HT2.2.6 0,48 0,67 0,56 0,56 0,65 0,48 
16. HT3.1.2 0,49 0,72 0,55 0,54 0,71 0,42 
17. HT2.2.2 0,50 0,65 0,52 0,51 0,65 0,46 
18. HT3.1.8 0,47 0,65 0,54 0,54 0,66 0,45 
19. HT3.2.5 0,52 0,67 0,55 0,57 0,67 0,50 
20. 27.6TN 0,53 0,73 0,52 0,53 0,71 0,47 
21. 11.1 TN 0,51 0,64 0,51 0,52 0,64 0,50 
22. TQ3.3 0,64 0,78 0,67 0,66 0,79 0,60 
23. TQL4.6 0,54 0,72 0,55 0,58 0,70 0,50 
24. Bt 1.4 0,51 0,73 0,54 0,54 0,74 0,45 
25. MSS1.1 0,59 0,78 0,62 0,64 0,78 0,57 
26. MSS7.6 0,52 0,68 0,55 0,56 0,67 0,46 
27. MSS6.4 0,53 0,66 0,56 0,54 0,67 0,47 
28. MSS6.3 0,58 0,74 0,63 0,64 0,75 0,57 
29. MSS8.3 0,49 0,69 0,54 0,52 0,68 0,48 
30. RH2.1 0,57 0,66 0,59 0,60 0,69 0,53 
31. HDC4.7 0,50 0,64 0,55 0,59 0,62 0,51 
Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV – Số 1/2019 
 16 
Như vậy, môi trường thích hợp cho lên men 
sinh tổng hợp chitinase của các chủng Bt nghiên 
cứu có tỷ lệ thành phần (g/L) như sau: bột ngô là 
10; K2HPO4 = 1; KH2PO4 =1, bột đậu tương =10; 
NaCl =2; MgSO4 =0,5; CaCl2 =1; MnSO4 =0,01; 
ZnSO4 =0,01; FeSO4 =0,01; bổ sung chitin huyền 
phù 0,5% với pH= 7 và nhiệt độ nuôi nhân 28ºC. 
3.4 Khả năng háng nấm gây bệnh thực vật 
Từ 31 chủng có đường kính vòng thủy phân 
chitin lớn (20- 30 mm), tiến hành thử hoạt tính 
kháng nấm F. oxysporum và R. solani. Kết quả, 
xác định được 5 chủng có khả năng kháng nấm, 
trong đó 1 chủng kháng cả 2 loại nấm (chủng 
MSS1.1), 4 chủng chỉ kháng 1 loại nấm (TD8.12, 
TQ3.3, MSS6.3 và MHY1.9) (bảng 5, hình 4). 
Trong đó, chủng Bt MSS1.1 có đường kính vòng 
ức chế đối với 2 loại nấm F. oxysporum và R. 
solani lần lượt là 13 và 8 mm. 
Việc phát hiện ra khả năng kháng nấm của một 
số chủng Bt rất có ý nghĩa trong việc mở ra triển 
vọng phát triển Bt thành một loại thuốc trừ sâu 
sinh học có tác dụng bảo vệ kép (Dual control), 
vừa trừ sâu vừa chống bệnh cho cây trồng. Ở Việt 
Nam, đây là nghiên cứu đầu tiên về tác dụng kép 
của vi khuẩn Bt trong bảo vệ thực vật. Trên thế 
giới, ngoài các kết quả nghiên cứu về vi khuẩn Bt 
diệt côn trùng từ nhiều năm về trước, gần đây đã 
có công bố về tác dụng kháng nấm gây bệnh thực 
vật của chitinase từ Bt [2]. 
Bảng 5. Hoạt tính háng nấm của các chủng Bt sinh chitinase 
STT Kí hiệu chủng 
Fusarium oxysporum 
(D-d)mm 
Rhizoctonia solani 
(D-d)mm 
1. MSS1.1 13 8 
2. TD8.12 8 - 
3. TQ3.3 5 - 
4. MSS6.3 - 7 
5. MHY1.9 5 - 
6. 4D4 (chủng chuẩn) 12 - 
Hình 4. Ảnh háng nấm F. oxysporum (A) và R. solani (B) của các chủng Bt 
4. KẾT LUẬN 
Từ 452 chủng Bt phân lập ở Việt Nam đã 
sàng lọc được 5 chủng có khả năng sinh tổng 
hợp chitinase cao và có khả năng ức chế sinh 
trưởng của 2 loại nấm gây bệnh thực vật là 
Fusarium oxysporum và Rhizoctonia solani, 
mở ra hướng nghiên cứu tạo chế phẩm Bt có 
tác dụng kép trong phòng trừ sâu - bệnh hại 
cây trồng. 
Lời cám ơn: Công trình được hoàn thành với 
sự trợ giúp kinh phí của đề tài cấp Viện Công 
nghệ sinh học: “Tạo bộ sưu tập các chủng vi 
khuẩn Bacillus thuringiensis có khả năng sinh 
chitinase khu vực Đông B c Bộ Việt Nam , m 
số CS18-14. 
Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV – Số 1/2019 
 17 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. Chauhan M and Singh P, 2013. 
Production, optimization and characterization of 
chitinase enzym by Bacillus suBt ilis. Res educ 
dev soc 1, 5-11 
2. De la Fuente-Salcido NM, Casados-
Vázquez LE, García-Pérez AP, Barboza-Pérez 
UE, Bideshi DK, Salcedo-Hernández R, 
Garcia-Almendarez BE, Barboza-Corona JE, 
2016 The endochitinase ChiA Bt t of Bacillus 
thuringiensis subsp. tenebrionis DSM-2803 
and its potential use to control the 
phytopathogen Colletotrichum 
gloeosporioides. Microbiology Open 5(5), 
819–829. 
3. George Z and Crickmore N, 2012. Bacillus 
thuringiensis Applications in Agriculture-Bacillus 
thuringiensis Biotechnology, Springer 
Science+Business Media, DOI 10.1007/978-94-
007-3021-2_2. 
4. Gomaa EZ, 2012. Chitinase production by 
Bacillus thuringiensis and Bacillus licheniformis: 
their potential in antifungal biocontrol. J 
Microbiol 50, 103-11 
5. Ni H, Zeng S, Qin X, Sun X, Zhang S, Zhao 
X, Yu Z, Li L, 2015. Molecular docking and site-
directed mutagenesis of a Bacillus 
thuringiensischitinase to improve chitinolytic, 
synergistic Lepidopteran-larvicidal and 
Nematicidal activities. Int J Biol Sci 11(3), 304-315 
6. Saleem F, Younas A, Bashir R, Naz S, 
Munir N and Shakoori AR (2014) Molecular 
cloning and characterization of exochitinase 
agene of indigenous Bacillus thuringiensis 
isolates. Pakistan J Zool 46(6), 1491-1501. 
7. Shivalee A, Divatar M, Sandhya G, Ahmed 
S, Lingappa K, 2016. Isolation and screening of 
soil microbes for extracellular chitinase activity. J 
Adv Sci Res 7(2), 10-14 
8. V Thị Thanh, V Văn Hạnh, Nghiêm 
Ngọc Minh, Quyền Đình Thi, 2013. Tối ưu hóa 
các điều kiện môi trường ảnh hưởng đến khả 
năng sinh tổng hợp chitinase của chủng nấm 
Penicillium sp. M4 phân lập từ ruộng mía. Kỷ 
yếu Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc 
2013. Nxb Khoa học tự nhiên và Công nghệ 1, 
484-488. 
Phản biện: PGS.TS. Lê Văn Trịnh 
 HIỆU QUẢ CỦA TINH DẦU SẢ VÀ DẦU TỎI TRONG LÀM GIẢM SỰ GÂY HẠI 
CỦA SÂU ĐỤC QUẢ CÂY CÓ MÖI Citripestis sagittiferella 
(Lepidoptera: Pyralidae) 
Effectiveness of Lemon Grass Essential and Garlic Oil in Reducing 
The Damage of The Citrus Fruit Borer Citripestis sagittiferella 
(Lepidoptera: Pyralidae) 
Trần Trọng Dũng, Phạm Văn Sol, Dƣơng Kiều Hạnh, 
Châu Nguyễn Quốc Khánh và Lê Văn Vàng
Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ 
Ngày nhận bài: 10.1.2019 Ngày chấp nhận: 15.2.2019 
Abstract 
The citrus fruit borer (Citripestis sagittiferella) is an important insect pest of citrus fruits in the Mekong delta of 
Viet Nam. In order to utilization of semiochemical as tool for a sustainable management program, effects of lemon 
grass essential and garlic oils on the damage of C. sagittiferella was evaluated at a “Nam roi” pomelo orchard in 
Soc Trang province. Results shown that, when used as disruptants, lemon grass essential and garlic oils gave 
effectiveness in decreasing the damage of C. sagittiferella from 37% to 66.7%, dependently on the kinds of