Tách dòng gien mã hóa phốtpho-LiPAZA C3 ở hai giống đậu xanh Vigna radiata (L.) Wilczek KP11 và MN93

 74 
28(4): 74-82 Tạp chí Sinh học 12-2006 
Tách dòng gien mã hóa phốTpho-liPAZA C3 ở hai giống đậu xanh 
Vigna radiata (L.) Wilczek KP11 và MN93 
Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hoàng Mậu 
Đại học Thái Nguyên 
Phạm Thị Vân, Lê Trần Bình 
Viện Công nghệ sinh học 
Đậu xanh Vigna radiata (L.) Wilczek là một 
trong những mặt hàng nông sản xuất khẩu với 
nhiều −u điểm quan trọng trong hệ thống sản 
xuất cây l−ơng thực và thực phẩm [1]. Cây đậu 
xanh chịu hạn, chịu úng kém. Việc nghiên cứu 
mối quan hệ giữa gien với khả năng chống chịu 
điều kiện ngoại cảnh bất lợi của cây đậu xanh 
còn ít đ−ợc đề cập đến. Trong nghiên cứu này, 
chúng tôi sử dụng hai giống đậu xanh KP11 và 
MN93 làm nguyên liệu để tách dòng và so sánh 
trình tự nucleotit của gien phốtpho-lipaza C3 
(PLC3) nhằm đ−a ph−ơng pháp sinh học phân tử 
vào nghiên cứu cây đậu xanh, cũng nh− góp 
phần rút ngắn thời gian chọn các giống đậu 
xanh phục vụ sản xuất. 
I. ph−ơng pháp nghiên cứu 
1. Vật liệu 
Hai giống đậu xanh KP11 và MN93 do Viện 
Khoa học Nông nghiệp Việt Nam cung cấp. 
Véctơ tách dòng pTZ57R/T do hãng Fermentas 
cung cấp. Các loại hóa chất, dụng cụ và thiết bị 
phục vụ cho thí nghiệm sinh học phân tử. 
Ba cặp mồi PLC3 ký hiệu F1, F2, F3 có 
trình tự nh− sau: 
STT Ký hiệu mồi Trình tự mồi Nhiệt độ gắn mồi 
1 F1 
5’ATGTCCAAGCAGACTTACAGC3’ 
5’CTCAGCCACTTTGGCCTGAAG3’ 
54oC 
2 F2 
5’GAGGTCTATTAAGCAGTATGC3’ 
5’AATGCAACCATCTGGGCTCCA3’ 
54oC 
3 F3 
5’AGGCACTCGTATTGCCTCAAC3’ 
5’TCAAATGAATTCAAAGCGCAT3’ 
54oC 
2. Ph−ơng pháp 
a. ADN tổng số đ−ợc tách chiết theo ph−ơng 
pháp Gawel và Jarnet [7] có cải tiến. Chất l−ợng 
và nồng độ ADN đ−ợc xác định bằng máy 
quang phổ hấp phụ của hãng Shimadzu (model 
8452A), Nhật Bản. 
b. Dựa trên cơ sở dữ liệu khai thác tại Ngân 
hàng gien quốc tế, chúng tôi thiết kế mồi để nhân 
gien phốtpho-lipaza C3. Vì đoạn gien này có kích 
th−ớc lớn (khoảng hơn 4000 nucleotit) nên rất 
khó biến nạp và không thể đọc trình tự nucleotit 
của gien đ−ợc. Do nh−ợc điểm trên, nên chúng 
tôi đã thiết kế 3 cặp mồi để nhân đoạn gien lớn 
này. Đặc điểm của 3 cặp mồi này là đ−ợc thiết kế 
gối lên nhau, để sau khi đọc xong trình tự 
nucleotit của 3 đoạn gien nhân bằng 3 cặp mồi 
này, thì có thể ghép lại thành gien hoàn chỉnh. 
Kích th−ớc dự kiến của 3 cặp mồi là: cặp mồi thứ 
nhất (ký hiệu F1) có kích th−ớc 1570 nucleotit, 
cặp mồi thứ hai (ký hiệu F2) có kích th−ớc 
1331 nucleotit và cặp mồi thứ ba (ký hiệu F3) có 
kích th−ớc 1482 nucleotit. 
c. Nhân gien PLC3 bằng kỹ thuật PCR. PCR 
đ−ợc tiến hành với tổng thể tích phản ứng 50 àl 
gồm: ADN mẫu (50 ng/àl) 4 àl, mồi (10 àM) 4 
àl, dNTP (2,5 mM) 4 àl, MgCl2 (25 mM) 5 àl, 
Taq polymeraza (5 U/àl) 0,8 àl, buffơ PCR 
(10X) 5 àl, H2O khử ion 27,2 àl. 
d. Chu trình nhiệt bao gồm các b−ớc sau: 
94oC-3 phút; 94oC-50 giây, 54oC-1 phút, 72oC-1 
phút 30 giây lặp lại 35 chu kỳ; 72oC - 10 phút và
 75 
l−u giữ ở 4oC. 
Tách dòng và đọc trình tự: sản phẩm PCR 
của gien PLC3 đ−ợc kiểm tra bằng điện di trên 
gel agaroza 1%, sau đó đ−ợc làm sạch (thôi gel) 
theo bộ Kit QIAquick Gel Extraction đ−ợc gắn 
trực tiếp vào véctơ pTZ57R/T và đ−ợc biến nạp 
vào tế bào khả biến của chủng Esherichia coli 
DH5α. Trình tự nucleotit của gien PLC3 đ−ợc 
xác định thành 3 đoạn F1, F2, F3 trên máy đọc 
trình tự nucleotit tự động ABI PRISM@ 3100 
Advant Genetic Analyzer của hãng Ampplied 
Biosystem. Kết quả đọc trình tự đ−ợc xử lý và 
nối ghép bằng phần mềm DNAstar và BioEdit. 
Sơ đồ thí nghiệm tổng quát: 
Hạt đậu xanh 
 ↓ 
Mầm 7 ngày tuổi 
 ↓ 
 ADN tổng số 
 ↓ 
 PCR với 3 cặp mồi F1, F2, F3 
 ↓ 
 F1 1570 nucleotit F2 1331 nucleotit F3 1482 nucleotit 
 ↓ 
 Dòng hóa 
 ↓ 
 Chọn dòng 
 ↓ 
 Tách plasmit 
 ↓ 
Đọc trình tự nucleotit của 3 đoạn gien. Xử lý và nối 3 đoạn thành gien PLC3 dài 4215 nucleotit 
II. Kết quả và thảo luận 
1. Nhân gien PLC3 của 2 giống đậu xanh 
KP11 và MN93 
Hình 1. Kết quả PCR nhân gien PLC3 của 2 
giống đậu xanh KP11 và MN93 với 3 cặp mồi F1, 
F2, F3 
Ghi chú: M. chỉ thị phân tử 100 bp; 1F1 và 2F1 là 
sản phẩm PCR của hai giống KP11 và MN93 với 
cặp mồi F1; 1F2 và 2F2 là sản phẩm PCR của hai 
giống KP11 và MN93 với cặp mồi F2; 1F3 và 2F3 
là sản phẩm PCR của hai giống KP11 và MN93 với 
cặp mồi F3. 
Với mục đích nhân đoạn gien mã hóa PLC3
 M 1F1 2F1 1F2 2F2 1F3 2F3 
2000 bp 
1500 bp 
 76 
ở đậu xanh, chúng tôi tiến hành tách chiết ADN 
tổng số với số l−ợng đủ lớn. Các mẫu ADN 
đ−ợc pha loãng ở nồng độ 50 ng và xác định mật 
độ hấp thụ tia tử ngoại trên máy quang phổ, đảm 
bảo đủ độ tinh khiết để tiến hành các b−ớc 
nghiên cứu tiếp theo. 
Dựa trên sự phân tích trình tự nucleotit của 
gien PLC3 ở giống đậu xanh đ−ợc công bố tại 
Ngân hàng gien quốc tế với mã số AY394078, 
chúng tôi đã thiết kế 3 cặp mồi F1, F2, F3 gối 
lên nhau để nhân và phát hiện sự có mặt của 
gien PLC3 ở 2 giống đậu xanh KP11 và MN93. 
Kích th−ớc của đoạn gien đ−ợc nhân lên bằng 
cặp mồi F1 khoảng 1570 nucleotit, bằng cặp 
mồi F2 khoảng 1330 nucleotit và bằng cặp mồi 
F3 khoảng 1480 nucleotit. Đoạn gien PLC3 của 
2 giống đậu xanh đ−ợc nhân lên bằng ph−ơng 
pháp PCR sử dụng 3 cặp mồi F1, F2, F3. Kết 
quả nhân gien đ−ợc kiểm tra bằng cách điện di 
trên gel agaroza 1% và đ−ợc thể hiện trên hình 
1. Hình 1 cho thấy mỗi mẫu nhận đ−ợc đoạn 
ADN đặc hiệu có kích th−ớc khoảng 1570 
nucleotit với cặp mồi F1, 1331 nucleotit với cặp 
mồi F2 và 1482 nucleotit với cặp mồi F3 so với 
thang ADN chuẩn; hàm l−ợng của sản phẩm đủ 
lớn để sử dụng cho việc tách dòng. 
2. Kết quả tách dòng gien PLC3 
Quá trình tách dòng đ−ợc thực hiện bằng 
cách gắn sản phẩm PCR đã tinh sạch vào véctơ 
tách dòng pTZ57R/T, sau đó biến nạp vào tế 
bào khả biến của chủng E. coli DH5α và đ−ợc 
cấy trải trên môi tr−ờng LB đặc có bổ sung 
ampixillin 100 mg/ml, X-gal 40 mg/ml và IPTG 
100 àM. ủ đĩa petri ở 37oC trong 16 giờ. Kết 
quả thu đ−ợc cả khuẩn lạc xanh và trắng. Tiến 
hành chọn dòng thông qua phản ứng colony-
PCR. Chọn khuẩn lạc trắng nuôi trong môi 
tr−ờng LB lỏng có bổ sung ampixillin 100 
mg/ml qua đêm. Lấy khuẩn của mỗi mẫu chạy 
phản ứng clony PCR với cặp mồi pUC18 để xác 
định khuẩn lạc có plasmit mang gien mong 
muốn. Vì cặp mồi pUC18 là cặp mồi đ−ợc thiết 
kế chung cho các véctơ tạo dòng nên khi kiểm 
tra sản phẩm PCR vừa dòng hóa thì kích th−ớc 
của các đoạn gien vừa nhân lên sẽ cao hơn 
khoảng 200 nucleotit so với nhân bằng cặp mồi 
đặc hiệu. Nh− vậy, kích th−ớc sau khi dòng hóa 
của đoạn gien đã đ−ợc nhân bằng cặp mồi F1 ở 
trên sẽ là 1770 nucleotit, đoạn gien đã đ−ợc 
nhân bằng cặp mồi F2 là 1531 nucleotit và đoạn 
gien đã đ−ợc nhân bằng cặp mồi F3 là 1682 
nucleotit. Sản phẩm colony PCR đ−ợc điện di 
kiểm tra trên gel agaroza 1% (hình 2). 
Hình 2. Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR 
trên gel agaroza 1% 
Ghi chú: nh− hình 1. 
Kết quả điện di trên hình 2 cho thấy sản 
phẩm colony PCR từ những khuẩn lạc trắng đều 
cho kết quả d−ơng tính. Tất cả các mẫu đều cho 
một băng duy nhất đúng kích th−ớc, chứng tỏ kết 
quả biến nạp và chọn dòng thực hiện tốt, phản 
ứng PCR đã đạt mức tối −u. Nh− vậy, có thể 
khẳng định là việc nối ghép sản phẩm PCR vào 
véctơ tách dòng đã đạt kết quả nh− mong muốn. 
Tiến hành chọn khuẩn lạc trắng t−ơng ứng 
với 2 mẫu nghiên cứu có sản phẩm colony PCR 
nh− mong muốn để tách plasmit theo bộ kit 
QIAprep Spin Miniprep. Sản phẩm ADN plasmit 
đ−ợc điện di trên gel agaroza 1%. Kết quả đ−ợc 
thể hiện ở hình 3. 
Hình 3. Kết quả điện di tách plasmit 
Ghi chú: 1F1 và 2F1 là plasmit của hai giống KP11 
và MN93 đ−ợc nhân bằng cặp mồi F1; 1F2 và 2F2 
là plasmit của hai giống KP11 và MN93 đ−ợc nhân 
bằng cặp mồi F2; 1F3 và 2F3 là plasmit của hai 
giống KP11 và MN93 đ−ợc nhân bằng cặp mồi F3. 
Kết quả điện di trên hình 3 cho thấy sản 
phẩm tách plasmit sạch, đảm bảo chất l−ợng và 
số l−ợng để tiến hành đọc trình tự nucleotit. 
 M 1F1 2F1 1F2 2F2 1F3 2F3 
2000 bp 
1500 bp 
1F1 2F1 1F2 2F2 1F3 2F3 
 77 
3. Kết quả xác định trình tự nucleotit 
Để xác định chính xác gien PLC3 đã đ−ợc 
tách dòng, chúng tôi tiến hành đọc trình tự 
nucleotit của 3 đoạn gien đ−ợc nhân lên bằng ba 
cặp mồi F1, F2, F3 trên máy đọc tự động ABI 
PRIMS 3100 Avant Genetic Analyzer theo cả 
chiều xuôi và chiều ng−ợc. Trình tự nucleotit 
của gien PLC3 của 2 mẫu nghiên cứu thu đ−ợc, 
đem phân tích, xử lý bằng phần mềm DNAstar 
và BioEdit. 
Kết quả cho thấy kích th−ớc của gien PLC3 
ở 2 mẫu nghiên cứu là 4215 nucleotit, gồm cả 
intron và exon. Vùng coding (vùng mã hóa) 
gồm 1776 nucleotit mã hóa 591 axít amin (trừ 
axit amin mở đầu). Khi so sánh 2 trình tự này 
trong BLAST của NCBI, kết quả cho biết đây là 
các trình tự nucleotit của gien mã hóa PLC3 của 
đậu xanh. Chúng tôi kết luận đã tách dòng thành 
công đoạn gien mã hóa PLC3 của đậu xanh. 
Sơ đồ cấu trúc của gien PLC3 của 2 giống 
đậu xanh KP11 và MN93 dài 4215 nucleotit với 
9 exon và 8 intron: 
E1 I1 E2 I2 E3 I3 E4 I4 E5 I5 E6 I6 E7 I7 E8 I8 E9 
E1 (exon 1) gồm 315 nucleotit: từ vị trí nucleotit 1 đến 314 (1..314) 
E2 (exon 2) gồm 197 nucleotit: 889..1085 
E3 (exon 3) gồm 136 nucleotit: 1438..1573 
E4 (exon 4) gồm 246 nucleotit: 1654..1899 
E5 (exon 5) gồm 230 nucleotit: 2004..2233 
E6 (exon 6) gồm 118 nucleotit: 2698..2815 
E7 (exon 7) gồm 153 nucleotit: 3481..3633 
E8 (exon 8) gồm 87 nucleotit: 3739..3825 
E9 (exon 9) gồm 294 nucleotit: 3922..4215 
I1 (intron 1) gồm 574 nucleotit: 315..888 
I2 (intron 2) gồm 352 nucleotit: 1086..1473 
I3 (intron 3) gồm 80 nucleotit: 1574..1653 
I4 (intron 4) gồm 104 nucleotit: 1900..2003 
I5 (intron 5) gồm 464 nucleotit: 2234..2697 
I6 (intron 6) gồm 665 nucleotit: 2816..3480 
I7 (intron 7) gồm 105 nucleotit: 3634..3738 
I8 (intron 8) gồm 96 nucleotit: 3826..3921 
4. So sánh trình tự nucleotit của 2 mẫu 
nghiên cứu KP11 và MN93 
Sau khi đọc trình tự, chúng tôi tiến hành phân 
tích trình tự nucleotit của 2 mẫu nghiên cứu KP11 
và MN93. Kết quả cho thấy trình tự nucleotit của 
đoạn gien PLC3 (dài 4215 nucleotit) ở 2 mẫu 
nghiên cứu có độ t−ơng đồng rất cao 99,8% (sai 
khác 8 nucleotit). Đó là các vị trí: ở vị trí 22 
nucleotit T ở KP11 đ−ợc thay bằng C ở MN93, vị 
trí 414 A (KP11) thay bằng G (MN93), vị trí 479 
T (KP11) thay bằng C (MN93), vị trí 297 C 
(KP11) thay bằng T (MN93), vị trí 1964 T (KP11) 
thay bằng G (MN93), vị trí 2979 C (KP11) thay 
bằng T (MN93), vị trí 3388 T (KP11) thay bằng C 
(MN93), vị trí 4194 A (KP11) thay bằng G 
(MN93). Điểm khác biệt về trình tự nucleotit của 
gien ở 2 mẫu nghiên cứu với trình tự nucleotit của 
gien đăng ký tại Ngân hàng gien quốc tế có mã số 
AY39407 [8] là: kích th−ớc gien của 2 mẫu 
nghiên cứu (KP11 và MN93) dài 4215 nucleotit 
còn của mẫu có mã số AY394078 (tại Ngân hàng 
gien quốc tế) là 5213 nucleotit. Sự khác biệt về 
chiều dài này không ảnh h−ởng đến đoạn mã hóa 
và trình tự axit amin vì đoạn thiếu hụt đó chỉ nằm 
ở vùng intron. Vì chiều dài của gien PLC3 quá dài 
(4215 nucleotit) nên chúng tôi không đ−a vào 
trong bài báo mà chỉ đ−a đoạn mã hóa axit amin 
của gien này ở d−ới đây. 
Sơ đồ cấu trúc của gien PLC3 của mẫu đậu xanh 
có mã số AY394078 tại Ngân hàng gien quốc tế: 
I1 E1 I2 E2 I3 E3 I4 E4 I5 E5 I6 E6 I7 E7 I8 E8 I9 E9 I10 
 78 
Sơ đồ trên cho thấy gien PLC3 của mẫu có 
mã số AY394078 cũng có 9 exon giống 2 mẫu 
nghiên cứu KP11 và MN93 nh−ng có thêm 2 
đoạn không mã hóa là I1 gắn vào phía tr−ớc 
đoạn E1 và I10 gắn vào phía sau đoạn E9. I1 
thực chất không phải là intron mà là 5'UTR, còn 
I10 là 3'UTR. 
Vùng mã hóa axit amin của gien PLC3 gồm 
có 9 exon nối lại với nhau theo thứ tự từ exon 1 
đến exon 9. 
So sánh các vùng exon mã hóa axit amin (có 
kích th−ớc 1776 nucleotit) của gien PLC3 ở 2 
giống đậu xanh KP11 và MN93 với giống đậu 
xanh tại Ngân hàng gien quốc tế có mã số 
AY394078, kết quả cho thấy trình tự nucleotit 
có độ t−ơng đồng cao, chỉ có 9 vị trí sai khác 
nhau là 22, 34, 142, 235, 297, 489, 627, 1287, 
1755 (hình 4). Các vị trí sai khác này t−ơng ứng 
với các vị trí 22, 34, 142, 235, 297, 1065, 1552, 
3525, 4194 ở trong gien khi ch−a loại intron. 
 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 
 10 20 30 40 50 
AY394078 ATGTCCAAGC AGACTTACAG CTTTTGCTTC TGCTTCCGCC GCCGCTTCAG 
KP11 ATGTCCAAGC AGACTTACAG CTTTTGCTTC TGCCTCCGCC GCCGCTTCAG 
MN93 ATGTCCAAGC AGACTTACAG CCTTTGCTTC TGCCTCCGCC GCCGCTTCAG 
 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 
 60 70 80 90 100 
AY394078 TCTCCCCGTG TCGGAGGCCC CTCCGGAGAT AAGGACCCTT TTCGACCGTT 
KP11 TCTCCCCGTG TCGGAGGCCC CTCCGGAGAT AAGGACCCTT TTCGACCGTT 
MN93 TCTCCCCGTG TCGGAGGCCC CTCCGGAGAT AAGGACCCTT TTCGACCGTT 
 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 
 110 120 130 140 150 
AY394078 ATTCCGATGA GAATGGAATC ATGACAGCCT CTCACGTCCG CAGTTTCCTG 
KP11 ATTCCGATGA GAATGGAATC ATGACAGCCT CTCACGTCCG CGGTTTCCTG 
MN93 ATTCCGATGA GAATGGAATC ATGACAGCCT CTCACGTCCG CGGTTTCCTG 
 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 
 160 170 180 190 200 
AY394078 GTTGAGGTGC AGAAGGAGGA GAGTGTCACT GAGGAGGAAG CACAGGCCAT 
KP11 GTTGAGGTGC AGAAGGAGGA GAGTGTCACT GAGGAGGAAG CACAGGCCAT 
MN93 GTTGAGGTGC AGAAGGAGGA GAGTGTCACT GAGGAGGAAG CACAGGCCAT 
 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 
 210 220 230 240 250 
AY394078 CATCGATGGC CACAAGCATC TCAGCATCTT TCACAGGAGG GGTCTCAATC 
KP11 CATCGATGGC CACAAGCATC TCAGCATCTT TCACCGGAGG GGTCTCAATC 
MN93 CATCGATGGC CACAAGCATC TCAGCATCTT TCACCGGAGG GGTCTCAATC 
 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 
 260 270 280 290 300 
AY394078 TTGAGAGTTT CTTCAACTAC CTCTTCAGTA GCAATAATAA TCCACCTCTC 
KP11 TTGAGAGTTT CTTCAACTAC CTCTTCAGTA GCAATAATAA TCCACCCCTC 
MN93 TTGAGAGTTT CTTCAACTAC CTCTTCAGTA GCAATAATAA TCCACCTCTC 
 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 
 310 320 330 340 350 
AY394078 TCGCCTTCTC TCGGGGTGCA CCAAGATATG TCTTCACCGT TGTCTCATTA 
KP11 TCGCCTTCTC TCGGGGTGCA CCAAGATATG TCTTCACCGT TGTCTCATTA 
MN93 TCGCCTTCTC TCGGGGTGCA CCAAGATATG TCTTCACCGT TGTCTCATTA 
 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 
 360 370 380 390 400 
AY394078 CTTCATTTAT ACTGGTCATA ATTCCTATCT AACTGGGAAC CAACTAAGCA 
KP11 CTTCATTTAT ACTGGTCATA ATTCCTATCT AACTGGGAAC CAACTAAGCA 
MN93 CTTCATTTAT ACTGGTCATA ATTCCTATCT AACTGGGAAC CAACTAAGCA 
 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 
 410 420 430 440 450 
AY394078 GTGACTGCAG TGACGTCCCC ATCATCAAGG CACTGCAGAA GGGTGTAAGG 
KP11 GTGACTGCAG TGACGTCCCC ATCATCAAGG CACTGCAGAA GGGTGTAAGG 
MN93 GTGACTGCAG TGACGTCCCC ATCATCAAGG CACTGCAGAA GGGTGTAAGG 
 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 
 460 470 480 490 500 
AY394078 GTGATTGAAT TAGATATATG GCCTAATGAA TCAAAGGAGG ATGTGGATGT 
KP11 GTGATTGAAT TAGATATATG GCCTAATGAA TCAAAGGATG ATGTGGATGT 
MN93 GTGATTGAAT TAGATATATG GCCTAATGAA TCAAAGGATG ATGTGGATGT 
 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 
 510 520 530 540 550 
AY394078 TCTTCATGGA AGGACATTGA CATCTCCTGT GGCCCTCATC AAATGTTTGA 
KP11 TCTTCATGGA AGGACATTGA CATCTCCTGT GGCCCTCATC AAATGTTTGA 
MN93 TCTTCATGGA AGGACATTGA CATCTCCTGT GGCCCTCATC AAATGTTTGA 
 79 
 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 
 560 570 580 59 ... AGAT 
KP11 ACCTTAGAAG ACCACCTTAC TCCCGACCTT CAGGCCAAAG TGGCTGAGAT 
MN93 ACCTTAGAAG ACCACCTTAC TCCCGACCTT CAGGCCAAAG TGGCTGAGAT 
 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 
 660 670 680 690 700 
AY394078 GATTACTCAA ACATTTGGAG ACATACTATT TTCTCCTGGC TCTGAAAGCT 
KP11 GATTACTCAA ACATTTGGAG ACATACTATT TTCTCCTGGC TCTGAAAGCT 
MN93 GATTACTCAA ACATTTGGAG ACATACTATT TTCTCCTGGC TCTGAAAGCT 
 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 
 710 720 730 740 750 
AY394078 TGAAGGAATT TCCTTCTCCT AAATCGCTTA AAAGGAGGAT TATCATATCA 
KP11 TGAAGGAATT TCCTTCTCCT AAATCGCTTA AAAGGAGGAT TATCATATCA 
MN93 TGAAGGAATT TCCTTCTCCT AAATCGCTTA AAAGGAGGAT TATCATATCA 
 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 
 760 770 780 790 800 
AY394078 ACCAAACCAC CTAAGGAGTA CATTGAGGCA AAAGAAGTTC AGGAAAAGGG 
KP11 ACCAAACCAC CTAAGGAGTA CATTGAGGCA AAAGAAGTTC AGGAAAAGGG 
MN93 ACCAAACCAC CTAAGGAGTA CATTGAGGCA AAAGAAGTTC AGGAAAAGGG 
 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 
 810 820 830 840 850 
AY394078 GGAGGGATCA CAAAAGGAAA AGCCTGTAGA TGATGAAGAA GCATGGGGGA 
KP11 GGAGGGATCA CAAAAGGAAA AGCCTGTAGA TGATGAAGAA GCATGGGGGA 
MN93 GGAGGGATCA CAAAAGGAAA AGCCTGTAGA TGATGAAGAA GCATGGGGGA 
 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 
 860 870 880 890 900 
AY394078 AAGAAGTTCC TAGTTTGAGA GGTGGCACTA TTTCTGATCA CAAGAACATC 
KP11 AAGAAGTTCC TAGTTTGAGA GGTGGCACTA TTTCTGATCA CAAGAACATC 
MN93 AAGAAGTTCC TAGTTTGAGA GGTGGCACTA TTTCTGATCA CAAGAACATC 
 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 
 910 920 930 940 950 
AY394078 GAGGATGAGG ATGATCTTGA CAATGAAGAT GATACTGATG AAGCAGAATA 
KP11 GAGGATGAGG ATGATCTTGA CAATGAAGAT GATACTGATG AAGCAGAATA 
MN93 GAGGATGAGG ATGATCTTGA CAATGAAGAT GATACTGATG AAGCAGAATA 
 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 
 960 970 980 990 1000 
AY394078 TTCACGTCAA AATGCATCAG ACGAATACAG ACGTTTAATT GCCATTCATG 
KP11 TTCACGTCAA AATGCATCAG ACGAATACAG ACGTTTAATT GCCATTCATG 
MN93 TTCACGTCAA AATGCATCAG ACGAATACAG ACGTTTAATT GCCATTCATG 
 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 
 1010 1020 1030 1040 1050 
AY394078 CTGGGAAGCC TAAAGGTGGA TTAACAGAAT GCCTCAAAGT GGATCCCGAT 
KP11 CTGGGAAGCC TAAAGGTGGA TTAACAGAAT GCCTCAAAGT GGATCCCGAT 
MN93 CTGGGAAGCC TAAAGGTGGA TTAACAGAAT GCCTCAAAGT GGATCCCGAT 
 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 
 1060 1070 1080 1090 1100 
AY394078 ACAGTGAAAC GTCTAAGTTT AAGTGAGCTA CAACTTGAAA AGGCTGCTGA 
KP11 ACAGTGAAAC GTCTAAGTTT AAGTGAGCTA CAACTTGAAA AGGCTGCTGA 
MN93 ACAGTGAAAC GTCTAAGTTT AAGTGAGCTA CAACTTGAAA AGGCTGCTGA 
 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 
 1110 1120 1130 1140 1150 
AY394078 AACTCATGGC AAAGAAATCA TAAGGTTTAC TCAGCGGAAT ATACTGAGAG 
KP11 AACTCATGGC AAAGAAATCA TAAGGTTTAC TCAGCGGAAT ATACTGAGAG 
MN93 AACTCATGGC AAAGAAATCA TAAGGTTTAC TCAGCGGAAT ATACTGAGAG 
 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 
 1160 1170 1180 1190 1200 
AY394078 TGTATCCAAA AGGCACTCGT ATTGCCTCAA CAAATTATAA TCCATTGATC 
KP11 TGTATCCAAA AGGCACTCGT ATTGCCTCAA CAAATTATAA TCCATTGATC 
MN93 TGTATCCAAA AGGCACTCGT ATTGCCTCAA CAAATTATAA TCCATTGATC 
 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 
 1210 1220 1230 1240 1250 
AY394078 GGGTGGATGC ATGGAGCCCA GATGGTTGCA TTCAACATGC AGGGATACGG 
KP11 GGGTGGATGC ATGGAGCCCA GATGGTTGCA TTCAACATGC AGGGATACGG 
 80 
MN93 GGGTGGATGC ATGGAGCCCA GATGGTTGCA TTCAACATGC AGGGATACGG 
 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 
 1260 1270 1280 1290 1300 
AY394078 TAGGTCTCTC TGGTTGATGC AGGGAATGTT CAAAGCGAAT GGGGGATGTG 
KP11 TAGGTCTCTC TGGTTGATGC AGGGAATGTT CAAAGCCAAT GGGGGATGTG 
MN93 TAGGTCTCTC TGGTTGATGC AGGGAATGTT CAAAGCCAAT GGGGGATGTG 
 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 
 1310 1320 1330 1340 1350 
AY394078 GTTATGTTAA GAAACCAGAT TTTCTGTTAA AGACTGGTCT TAATAATGAG 
KP11 GTTATGTTAA GAAACCAGAT TTTCTGTTAA AGACTGGTCT TAATAATGAG 
MN93 GTTATGTTAA GAAACCAGAT TTTCTGTTAA AGACTGGTCT TAATAATGAG 
 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 
 1360 1370 1380 1390 1400 
AY394078 GTCTTTGATC CTAAAGCTCG TTTGCCGGTG AAGAAAACTT TGAAAGTGAC 
KP11 GTCTTTGATC CTAAAGCTCG TTTGCCGGTG AAGAAAACTT TGAAAGTGAC 
MN93 GTCTTTGATC CTAAAGCTCG TTTGCCGGTG AAGAAAACTT TGAAAGTGAC 
 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 
 1410 1420 1430 1440 1450 
AY394078 TATATATATG GGGGAAGGAT GGTTTCATGA TTTCAAGCAC ACGCACTTTG 
KP11 TATATATATG GGGGAAGGAT GGTTTCATGA TTTCAAGCAC ACGCACTTTG 
MN93 TATATATATG GGGGAAGGAT GGTTTCATGA TTTCAAGCAC ACGCACTTTG 
 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 
 1460 1470 1480 1490 1500 
AY394078 ATCAATACTC ACCCCCTGAC TTCTATGCAA GAGTGGGGAT TGCTGGAGTC 
KP11 ATCAATACTC ACCCCCTGAC TTCTATGCAA GAGTGGGGAT TGCTGGAGTC 
MN93 ATCAATACTC ACCCCCTGAC TTCTATGCAA GAGTGGGGAT TGCTGGAGTC 
 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 
 1510 1520 1530 1540 1550 
AY394078 CCTTATGATA CTGTTATGAA AAAAACAAAG AGCGTGGAGG ATAATTGGTC 
KP11 CCTTATGATA CTGTTATGAA AAAAACAAAG AGCGTGGAGG ATAATTGGTC 
MN93 CCTTATGATA CTGTTATGAA AAAAACAAAG AGCGTGGAGG ATAATTGGTC 
 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 
 1560 1570 1580 1590 1600 
AY394078 TCCATCATGG AATGAGGAAT TTAAGTTTCC ACTTTCTGTT CCAGAACTGG 
KP11 TCCATCATGG AATGAGGAAT TTAAGTTTCC ACTTTCTGTT CCAGAACTGG 
MN93 TCCATCATGG AATGAGGAAT TTAAGTTTCC ACTTTCTGTT CCAGAACTGG 
 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 
 1610 1620 1630 1640 1650 
AY394078 CTCTGCTTCG TGTAGAAGTT CATGAATATG ACATGTCTGA GAAAGATGAC 
KP11 CTCTGCTTCG TGTAGAAGTT CATGAATATG ACATGTCTGA GAAAGATGAC 
MN93 CTCTGCTTCG TGTAGAAGTT CATGAATATG ACATGTCTGA GAAAGATGAC 
 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 
 1660 1670 1680 1690 1700 
AY394078 TTTGGTGGCC AAACTTGCTT ACCTGTGTGG GAACTGAGAA GTGGAATTCG 
KP11 TTTGGTGGCC AAACTTGCTT ACCTGTGTGG GAACTGAGAA GTGGAATTCG 
MN93 TTTGGTGGCC AAACTTGCTT ACCTGTGTGG GAACTGAGAA GTGGAATTCG 
 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 
 1710 1720 1730 1740 1750 
AY394078 TGCAGTTCCA TTATATTCCC GCAAAGGAGA AAAGTACCAC AATGTGAAGC 
KP11 TGCAGTTCCA TTATATTCCC GCAAAGGAGA AAAGTACCAC AATGTGAAGC 
MN93 TGCAGTTCCA TTATATTCCC GCAAAGGAGA AAAGTACCAC AATGTGAAGC 
 ....|....| ....|....| ....|. 
 1760 1770 
AY394078 TTCTAATGCG CTTTGAATTC ATTTGA 
KP11 TTCTAATGCG CTTTGAATTC ATTTGA 
MN93 TTCTGATGCG CTTTGAATTC ATTTGA 
Hình 4. So sánh trình tự của các vùng exon của các giống đậu xanh KP11, MN93 và AY394078 
5. So sánh trình tự nucleotit của 2 gien 
PLC3 nghiên cứu (vùng mã hóa axit 
amin) với trình tự của các gien PLC3 của 
một số cây trồng khác 
Chúng tôi tiến hành so sánh trình tự nucleotit 
của 2 gien PLC3 nghiên cứu với các trình tự 
nucleotit của gien PLC3 ở một số cây trồng khác 
có tên và mã số đăng ký tại Ngân hàng gien quốc 
tế: đậu xanh Vigna radiata (L) Wilczek 
(AY394078) [7], khoai tây Solanum tuberosum L. 
(X94289) [8], đậu t−ơng Glycine max (L.) Merr 
(U25027) [13], ngô Zea mays L. (AY536525) [9], 
đậu hà lan Pisum sativum L. (Y15253) [10], thuốc 
 81 
lá Nicotiana tabacum L. (X95877) [11], đậu dải 
Vigna unguiculata (L.) Walp. (U85250) [12]. 
Kết quả cho thấy 2 mẫu nghiên cứu có độ 
t−ơng đồng cao nhất so với mẫu AY394078 
(đậu xanh); giống KP11 có độ t−ơng đồng là 
99,6% và giống MN93 có độ t−ơng đồng là 
99,5%. Tiếp đến là Pisum sativum L. (80,6%) và 
thấp nhất là Zea mays L. (54,7%). Kết quả so 
sánh thể hiện ở bảng 1. 
Bảng 1 
So sánh trình tự nucleotit của gien PLC3 của 
9 loại cây trồng khác nhau 
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 
1 100 99,8 99,6 65,7 76,4 54,8 80,6 58,2 55,5 
2 100 99,5 65,8 76,4 54,7 80,6 57,4 55,3 
3 100 65,7 76,5 57,4 80,5 57,6 55,5 
4 100 64,2 52,9 64,1 58,4 53,0 
5 100 52,8 76,0 59,7 58,1 
6 100 52,9 54,1 53,5 
7 100 58,9 57,5 
8 100 58,9 
9 100 
Ghi chú: 1. KP11; 2. MN93; 3. Vigna radiata (L.) 
Wilczek (AY394078); 4. Solanum tuberosum L. 
(X94289); 5. Glycine max (L.) Merr. (U25027); 6. 
Zea mays L. (AY536525); 7. Pisum sativum L. 
(Y15253); 8. Nicotiana tabacum L. (X95877); 9. 
Vigna unguiculata (L.) Walp (U85250). 
6. So sánh trình tự axit amin của hai giống đậu 
xanh KP11 và MN93 với giống đậu xanh tại 
Ngân hàng gien quốc tế có mã số AY394078 
Kết quả so sánh trình tự axit amin của 2 giống 
đậu xanh nghiên cứu cũng có độ t−ơng đồng rất 
cao 99,8%, chỉ sai khác 1 axit amin ở vị trí số 8. ở 
vị trí số 8, axit amin L của KP11 đ−ợc thay bằng 
axit amin F của MN93. So sánh trình tự axit amin 
của giống đậu xanh có mã số AY394078 tại Ngân 
hàng gien quốc tế với 2 giống đậu xanh nghiên 
cứu cho thấy 3 giống này có độ t−ơng đồng cao, 
chỉ sai khác về trình tự axit amin ở 4 vị trí 8, 12, 
48 và 163. Kết quả thể hiện ở hình 5. 
 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 
 10 20 30 40 50 
AY394078 MSKQTYSFCF CFRRRFSLPV SEAPPEIRTL FDRYSDENGI MTASHVRSFL 
KP11 MSKQTYSLCF CLRRRFSLPV SEAPPEIRTL FDRYSDENGI MTASHVRGFL 
MN93 MSKQTYSFCF CLRRRFSLPV SEAPPEIRTL FDRYSDENGI MTASHVRGFL 
 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 
 60 70 80 90 100 
AY394078 VEVQKEESVT EEEAQAIIDG HKHLSIFHRR GLNLESFFNY LFSSNNNPPL 
KP11 VEVQKEESVT EEEAQAIIDG HKHLSIFHRR GLNLESFFNY LFSSNNNPPL 
MN93 VEVQKEESVT EEEAQAIIDG HKHLSIFHRR GLNLESFFNY LFSSNNNPPL 
 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 
 110 120 130 140 150 
AY394078 SPSLGVHQDM SSPLSHYFIY TGHNSYLTGN QLSSDCSDVP IIKALQKGVR 
KP11 SPSLGVHQDM SSPLSHYFIY TGHNSYLTGN QLSSDCSDVP IIKALQKGVR 
MN93 SPSLGVHQDM SSPLSHYFIY TGHNSYLTGN QLSSDCSDVP IIKALQKGVR 
 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 
 160 170 180 190 200 
AY394078 VIELDIWPNE SKEDVDVLHG RTLTSPVALI KCLRSIKQYA FVASEYPVVI 
KP11 VIELDIWPNE SKDDVDVLHG RTLTSPVALI KCLRSIKQYA FVASEYPVVI 
MN93 VIELDIWPNE SKDDVDVLHG RTLTSPVALI KCLRSIKQYA FVASEYPVVI 
 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 
 210 220 230 240 250 
AY394078 TLEDHLTPDL QAKVAEMITQ TFGDILFSPG SESLKEFPSP KSLKRRIIIS 
KP11 TLEDHLTPDL QAKVAEMITQ TFGDILFSPG SESLKEFPSP KSLKRRIIIS 
MN93 TLEDHLTPDL QAKVAEMITQ TFGDILFSPG SESLKEFPSP KSLKRRIIIS 
 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 
 260 270 280 290 300 
AY394078 TKPPKEYIEA KEVQEKGEGS QKEKPVDDEE AWGKEVPSLR GGTISDHKNI 
KP11 TKPPKEYIEA KEVQEKGEGS QKEKPVDDEE AWGKEVPSLR GGTISDHKNI 
MN93 TKPPKEYIEA KEVQEKGEGS QKEKPVDDEE AWGKEVPSLR GGTISDHKNI 
 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 
 310 320 330 340 350 
AY394078 EDEDDLDNED DTDEAEYSRQ NASDEYRRLI AIHAGKPKGG LTECLKVDPD 
KP11 EDEDDLDNED DTDEAEYSRQ NASDEYRRLI AIHAGKPKGG LTECLKVDPD 
MN93 EDEDDLDNED DTDEAEYSRQ NASDEYRRLI AIHAGKPKGG LTECLKVDPD 
 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 
 360 370 380 390 400 
AY394078 TVKRLSLSEL QLEKAAETHG KEIIRFTQRN ILRVYPKGTR IASTNYNPLI 
 82 
KP11 TVKRLSLSEL QLEKAAETHG KEIIRFTQRN ILRVYPKGTR IASTNYNPLI 
MN93 TVKRLSLSEL QLEKAAETHG KEIIRFTQRN ILRVYPKGTR IASTNYNPLI 
 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 
 410 420 430 440 450 
AY394078 GWMHGAQMVA FNMQGYGRSL WLMQGMFKAN GGCGYVKKPD FLLKTGLNNE 
KP11 GWMHGAQMVA FNMQGYGRSL WLMQGMFKAN GGCGYVKKPD FLLKTGLNNE 
MN93 GWMHGAQMVA FNMQGYGRSL WLMQGMFKAN GGCGYVKKPD FLLKTGLNNE 
 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 
 460 470 480 490 500 
AY394078 VFDPKARLPV KKTLKVTIYM GEGWFHDFKH THFDQYSPPD FYARVGIAGV 
KP11 VFDPKARLPV KKTLKVTIYM GEGWFHDFKH THFDQYSPPD FYARVGIAGV 
MN93 VFDPKARLPV KKTLKVTIYM GEGWFHDFKH THFDQYSPPD FYARVGIAGV 
 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 
 510 520 530 540 550 
AY394078 PYDTVMKKTK SVEDNWSPSW NEEFKFPLSV PELALLRVEV HEYDMSEKDD 
KP11 PYDTVMKKTK SVEDNWSPSW NEEFKFPLSV PELALLRVEV HEYDMSEKDD 
MN93 PYDTVMKKTK SVEDNWSPSW NEEFKFPLSV PELALLRVEV HEYDMSEKDD 
 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| . 
 560 570 580 590 
AY294078 FGGQTCLPVW ELRSGIRAVP LYSRKGEKYH NVKLLMRFEF I 
KP11 FGGQTCLPVW ELRSGIRAVP LYSRKGEKYH NVKLLMRFEF I 
MN93 FGGQTCLPVW ELRSGIRAVP LYSRKGEKYH NVKLLMRFEF I 
Hình 5. So sá nh trình tự axit amin của hai giống đậu xanh KP11 và MN93 với giống đậu xanh có mã số AY394078 
Chúng tôi tiến hành so sánh trình tự axit 
amin của gien PLC3 ở 2 giống đậu xanh KP11 
và MN93 với các trình tự axit amin của gien 
PLC3 ở một số cây trồng khác. Kết quả cho 
thấy, 2 mẫu nghiên cứu có độ t−ơng đồng cao 
nhất với AY394078 (99,5%), tiếp đến là Pisum 
sativum L. (81,4%) và thấp nhất là Zea mays L. 
(57,2%). Kết quả thể hiện ở bảng 2. 
Bảng 2 
So sánh trình tự axit amin của 9 loại cây 
trồng khác nhau 
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 
1 100 99,8 99,5 68,4 74,3 57,2 81,4 61,7 57,6 
2 100 99,3 68,4 74,3 57,2 81,4 61,7 57,6 
3 100 68,4 74,1 57,2 81,2 61,7 57,6 
4 100 64,4 56,6 68,2 62,4 55,4 
5 100 55,6 75,1 63,4 58,5 
6 100 56,3 59,4 57,5 
7 100 62,6 57,7 
8 100 62,8 
9 100 
Ghi chú: nh− bảng 1. 
III. Kết luận 
Chúng tôi đã tách chiết và tinh sạch ADN 
tổng số của 2 giống đậu xanh Vigna radiata (L.) 
Wilczek KP11 và MN93. Gien phốtpho-lipaza 
C3 đ−ợc nhân lên bằng phản ứng PCR với 3 cặp 
mồi F1, F2, F3 đ−ợc thiết kế dựa trên cơ sở dữ 
liệu khai thác tại Ngân hàng gien quốc tế. Sản 
phẩm PCR đ−ợc dòng hóa nhờ véctơ pTZ57R/T.
Toàn bộ trình tự nucleotit của các dòng sản 
phẩm PCR đ−ợc xác định và xử lý cho kết quả 
gien PLC3 của 2 giống đậu xanh nghiên cứu dài 
4215 nucleotit, trong đó có 9 exon và 8 intron. 
Đoạn gien mã hóa dài 1776 nucleotit và mã hóa 
sản phẩm protein dài 591 axit amin (trừ axit 
amin mở đầu). So sánh trình tự nucleotit và trình 
tự axit amin của gien PLC3 của 2 giống đậu 
xanh nghiên cứu với các trình tự t−ơng tự của 
gien PLC3 của giống đậu xanh có mã số 
AY394078 tại Ngân hàng gien quốc tế cho thấy 
các gien PLC3 thu đ−ợc có độ t−ơng đồng cao. 
TàI liệu tham khảo 
1. Trần Đình Long, Lê Khả T−ờng, 1998: 
Cây đậu xanh. Nxb. Nông nghiệp. 
2. Knight H., 2000: Int. Rev. Cyto., 195: 269-
325. 
3. Sanders D., Brownlee C. and Harper J. 
F., 1999: Plant cell, 11: 691-706. 
4. Trewavas A. J. and Gilroy S., 1991: 
Trends Gene, 7: 356-361. 
5. Yun Ju Kim et al., 2003: FEBS Letters 
(2004), 556: 127-136. 
6. Zhu J. K., 2002: Ann. Rev. Plant Biol., 53: 
247-273. 
7. Gawel N. J., Jarret R. H., 1991: Genomic 
DNA isolation.  
de/pbpz/bambra/html/dna.html. 
8.  
 83 
Cloning of the encoding phospholipase C3 gene from two 
mungbean (Vigna radiata (L.) Wilczek) cultivars kp11 and Mn93 
Nguyen Vu Thanh Thanh, Chu Hoang Mau, 
Pham thi van, Le tran binh 
summary 
Mungbean Vigna radiata (L.) Wilczek is a grain legume widely grown in the tropics and subtropics and 
is an excellent source of dietary protein. Many biotic and abiotic stresses such as disease and drought limit 
the mungbean yield. In this study, 2 mungbean cultivars KP11 and MN93 were subjected to PCR analysis 
using 3 primer pairs (F1, F2, F3). A 4.2 k b phospholipase C3 (PLC3) gene fragment from the mungbean 
genome was successfully amplified by PCR. The PCR products containing the PLC3 fragments were cloned 
in pTZ57R/T and sequenced with three primer pairs (3 forward and 3 reverse primer). The cloned PLC3 gene 
had 4215 nucleotides in length, including start codon and stop codons, intron and exon. The coding region 
of PLC3 comprised 1776 nucleotides, encoding a polypeptide of 591 amino acids. 
Ngày nhận bài: 20-3-2006