Ứng dụng công nghệ sinh học trong xác định tính đồng nhất, tính khác biệt và tính ổn định của lúa phục vụ cho khảo nghiệm DUS

Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất 
251 
ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG XÁC ĐỊNH 
TÍNH ĐỒNG NHẤT, TÍNH KHÁC BIỆT VÀ TÍNH ỔN ĐỊNH 
CỦA LÚA PHỤC VỤ CHO KHẢO NGHIỆM DUS 
Lưu Minh Cúc, Lưu Thị Ngọc Huyền, 
Lê Huy Hàm 
Viện Di truyền Nông nghiệp 
SUMMARY 
(Application of biotechnology in identifying the distinctness, uniformity, 
stability of rice varieties to aid for DUS testing) 
This study aimed at developing procedures for identifying the distinctness, uniformity, stability of 
rice varieties to aid for DUS testing. The collection of 261 lines/varieties, which are abundant about 
sources, desease resistance, tolerance to biotic and abiotic stresses, were used in screening. Using the 
information from published data about DUS testing on rice in country around the world like China, Brazil, 
India..., walk along 12 rice chromosomes, 557 markers were selected. The use of those markers to 
screen with the large numbers of rice varieties were carried out. A strategy of upside down conical in 
many steps of screening was applied. At last, a reference set of DNA markers were selected. This set was 
including 30 markers. Procedures for identifying the distinctness, uniformity, stability of rice varieties to 
aid for DUS testing were developed. These procedures are tightly suitable to current DUS testing 
regulations. In addtion, a software namely DUS-DFP, with the DNA fingerprint data of 180 rice varieties 
base on 30 reference markers, was developed for applying all the results of this study in DUS testing 
purpose. 
Keywords: biotechnology, distinctness, uniformity, stability, DUS testing, rice. 
I. ĐẶT VẤN ĐỀ* 
Theo tiêu chuẩn của Hiệp hội Quốc tế về 
Bảo vệ Giống cây trồng mới (International 
Union for the Protection of New Varieties of 
Plants), các cây trồng mới được chọn tạo phải 
trải qua khâu kiểm nghiệm theo tiêu chí DUS 
(bao gồm khảo nghiệm tính khác biệt - 
distinctness, tính đồng nhất - uniformity và tính 
ổn định - stability). Trong 10 năm gần đây, mỗi 
năm Trung tâm Khảo Kiểm nghiệm giống, sản 
phẩm cây trồng Quốc gia thường gặp phải tình 
trạng (5 - 10 trường hợp mỗi năm) các giống 
đưa ra khảo nghiệm có các đặc điểm hình thái 
(thỉnh thoảng cả đặc điểm hóa sinh) khó phân 
biệt. Trong một số trường hợp, giống cây trồng 
của các tác giả khác nhau hoặc được nhập nội có 
tên gọi khác nhau, nhưng về mặt hình thái lại rất 
giống nhau, gây ra những tranh cãi khó giải 
quyết. Câu hỏi đặt ra là thực chất chúng thuộc 
một giống hay các giống khác nhau? Các tiêu 
chí khảo nghiệm DUS truyền thống dựa trên 62 
đặc điểm hình thái và hóa sinh cho thấy chưa đủ 
Người phản biện: TS. Lã Tuấn Nghĩa 
cơ sở để phân biệt các giống với nhau. Điều này 
gây nhiều khó khăn và cản trở trong việc xác 
minh bản quyền về giống cây trồng. Những tiến 
bộ gầy đây trong công nghệ sinh học nói chung 
và sinh học phân tử thực vật nói riêng đã có 
nhiều đóng góp tích cực không chỉ trong việc 
chọn tạo ra những giống cây trồng mới mà còn 
giúp phân biệt các đặc điểm di truyền của các bộ 
giống mới được chọn tạo hoặc giống nhập nội. 
Cho đến nay, nhiều nước trên thế giới sử dụng 
hệ thống khảo nghiệm DUS dựa trên cơ sở các 
đặc điểm hình thái và hóa sinh. Tuy nhiên, một 
số quốc gia đã bắt đầu áp dụng phương pháp 
ADN dùng cho khảo nghiệm DUS (Navraj và 
cs., 2009). Đối với công tác khảo nghiệm DUS 
ở nước ta, việc xây dựng một qui trình giám 
định giống chính xác ở mức độ phân tử là một 
việc làm hết sức cần thiết. Góp phần vào công 
tác khảo nghiệm DUS giống lúa nhằm xác định 
tính đúng giống, cũng như để tránh khỏi những 
tranh cãi, đồng thời bảo hộ bản quyền tác giả, 
chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu ứng dụng 
công nghệ sinh học trong xác định tính đồng 
nhất, tính ổn định và tính khác biệt của lúa phục 
vụ cho khảo nghiệm DUS. 
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 
252 
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
2.1. Vật liệu 
- Tập đoàn 261 giống lúa thu thập 
- 40 giống lúa để đánh giá DUS 
- 180 giống lúa để lập cơ sở dữ liệu 
- 19 giống lúa điển hình của Trung tâm Khảo 
nghiệm. 
- 19 giống lúa giống nhau theo cặp trong 
khảo nghiệm DUS năm 2010- 2012 
- Tổng số 557 chỉ thị phân tử đã dùng để 
khảo sát lập bộ chỉ thị tham chiếu 
- Các vật tư hoá chất sinh học phân tử 
chuyên dụng. 
2.2. Phương pháp nghiên cứu 
- Tách chiết ADN tổng số theo phương pháp 
CTAB cải tiến (của Phòng thí nghiệm Di truyền 
học, Trường Đại học Gent, Bỉ). 
- Phương pháp PCR (Michael and Simon 
2006). 
- Điện di gel polyacrylamide biến tính và 
không biến tính (PTN IRRI-Phillipine). 
- Thí nghiệm đồng ruộng được tiến hành 
theo Quy phạm khảo nghiệm tính khác biệt, tính 
đồng nhất và tính ổn định của giống lúa 10TCN 
554-2002. 
- Các biện pháp kỹ thuật khác được tiến hành 
theo Quy phạm khảo nghiệm giá trị canh tác và 
giá trị sử dụng giống lúa 10TCN 558-2002. 
- Xử lý số liệu thu được bằng phân tích trên 
phần mềm POPGEN 1.31 và NTSYS 2.1, Power 
Marker 3.0. 
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 
3.1. Nghiên cứu xác định nguồn vật liệu và 
thiết lập bộ chỉ thị tham chiếu 
Đề tài đã thu thập được tập đoàn 261 
dòng/giống lúa để sử dụng trong đề tài nhằm 
sàng lọc tìm kiếm các alen có thể có trên các 
giống lúa đối với các chỉ thị được sử dụng trong 
nghiên cứu. 
Bước đầu tiên, nghiên cứu tiến hành khảo sát 
261 giống lúa thu thập từ nhiều nguồn khác nhau 
đối với 100 chỉ thị gồm 81 chỉ thị SSR rải rác 
trên 12 NST có số lượng từ 3-8 alen và 19 chỉ thị 
thiết kế khi nghiên cứu vùng bảo thủ của các 
promoter tập trung vào các cis-element hay chính 
là trình tự điều khiển để nhân tố phiên mã bám 
vào và điều hòa biểu hiện gene và các EST ở lúa. 
Mở rộng phạm vi tìm kiếm, bước tiếp theo 
được tiến hành với 152 chỉ thị InDel marker 
được thiết kế dựa trên sự so sánh trình tự hệ gen 
của giống lúa Indica 93-11 và giống lúa Japonica 
Nipponbare, có thể xác định được sự đa hình từ 
các đột biến thêm/bớt (insertion/delection) trong 
hệ gen lúa. Đây chính là những chỉ thị đa hình 
cao và hoạt động tốt được sàng lọc từ 756 chỉ thị 
STS nằm trên toàn bộ hệ gen lúa với khoảng cách 
2-3 cM/chỉ thị phân bố tương đối đều trên 12 
NST của lúa. Sản phẩm nhân bản của đoạn ADN 
từ các chỉ thị này có thể chứa ít nhất 5% đoạn 
chèn-xóa khác nhau của kích thước các băng 
nhận được (trong khoảng từ 100-400bp). Những 
chỉ thị này có thể phân biệt rất tốt những sự khác 
biệt giữa các giống lúa mới được tạo ra bằng lai 
tạo, đột biến, phân biệt giữa các giống lúa thuộc 
loài phụ Indica và Japonica... Để thực hiện tốt 
hơn công việc sàng lọc tìm kiếm chỉ thị của đề 
tài, chúng tôi đã tìm kiếm, tiếp cận thêm các 
thông tin về chỉ thị phân tử, chọn lọc thông tin, 
tiến hành thu thập và lọc cơ sở dữ liệu, từ đó đề 
tài đã sử dụng thêm các chỉ thị trên 12 NST, dọc 
theo bản đồ genome của lúa, đã chọn được thêm 
hơn 300 chỉ thị SSR đã cho kết quả hoạt động tốt 
từ các nghiên cứu được tham khảo, đã được sử 
dụng để đánh giá đa dạng di truyền, nghiên cứu 
sự khác biệt, lập bản đồ, đánh giá DUS... trên các 
nghiên cứu trong và ngoài nước, cho băng ADN 
rõ ràng để sàng lọc chỉ thị đa hình cao cho bộ chỉ 
thị tham chiếu. 
Nghiên cứu được tiến hành trên tổng số 557 
chỉ thị SSR với 261giống để sàng lọc tìm chỉ thị 
cho đa hình cao trên tập đoàn giống lúa phong 
phú. Chỉ những chỉ thị cho băng vạch rõ ràng và 
có dấu hiệu cho đa hình sẽ được chọn cho bước 
sàng lọc tiếp theo. Kích thước của các alen đối 
với những chỉ thị cho băng vạch ADN rõ nét và 
kích thước băng phù hợp được ghi nhận lại để 
chọn lựa, loại bỏ dần những chỉ thị không phù 
hợp. Các locus SSR được sử dụng cho mục đích 
xác định cá thể phải thoả mãn được một số yêu 
cầu nhất định. Thứ nhất, các locus SSR đó phải 
có mức độ đa hình cao (nhiều alen), điều này 
giúp các nhà phân tích chỉ cần sử dụng số lượng 
locus tối thiểu đã đạt được độ tin cậy cao trong 
mỗi lần giám định. Thứ hai, các locus SSR đó 
phải có độ dài trung bình từ 85 - 400 bp, để có 
thể dễ dàng thực hiện phản ứng PCR và thao tác 
nhuộm phát hiện băng ADN trên gel 
Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất 
253 
polyacrylamide. Thứ ba, các locus SSR được sử 
dụng để phân tích phải nằm trên các NST khác 
nhau để đảm bảo cho tính độc lập của từng locus. 
Thứ tư, các locus SSR nằm trên những vùng liên 
quan đến hoạt động sống của cơ thể. Thứ năm, 
các chỉ thị cho kết quả tốt, rõ nét, thuận lợi cho 
sử dụng, dễ phân biệt trên gel polyacrylamide. 
Bộ chỉ thị tham chiếu được chọn lựa khi hội tụ 
đầy đủ các đặc điểm như yêu cầu ở trên. 
Cơ sở khoa học để tính toán sự khác biệt 
trong việc xác định số lượng và chỉ thị cho bộ chỉ 
thị tham chiếu: Mỗi kiểu gen (genotype) cây nhị 
bội mang 2 alen đối với từng locus. Giả sử tần 
suất xuất hiện tất cả các alen trong 1 quần thể 
ngẫu nhiên là bằng nhau, đối với cây lúa là cây tự 
thụ phấn (mỗi cặp alen là đồng hợp tử), số tổ hợp 
các cặp alen sẽ bằng tích của số alen của từng 
locut khảo sát (Riêng đối với cây thụ phấn chéo 
là cây dị hợp tử, số tổ hợp các cặp alen sẽ lớn 
hơn gấp nhiều lần so với cây tự thụ phấn). 
Bộ chỉ thị sơ bộ gồm 5 locus: RM11: 5 
alen; RM21: 6 alen; RM163: 6alen; RM 481: 
12 alen; RM3412:11 alen. Nếu sử dụng cả 5 
locus trên thì số tổ hợp cặp alen sẽ bằng 5 6 
6 12 11 = 23.760 tổ hợp. Hay nói một cách 
khác, nếu sử dụng bộ chỉ thị bao gồm 5 locus 
trên, ta có thể phân biệt được 23.760 mẫu lúa, 
khác nhau ít nhất bởi 1 cặp alen. 
Bảng 1. Danh sách các chỉ thị trong bộ chỉ thị tham chiếu 
TT Chỉ thị NST Số alen Kích thước alen (số bp) 
A Bộ chỉ thị sơ bộ 
1 RM11 7 5 120-125-132-136-140 
2 RM21 11 6 125-128-132-137-150-156 
3 RM163 5 6 130-135-140-153-160-170 
4 RM481 7 12 124-132-139-149-154-158-172-177-182-192-210-224 
5 RM3412 1 11 148-150-154-155-160-163-165-167-168-182-190 
B Bộ chỉ thị tham chiếu chính thức: bao gồm 5 chỉ thị của bộ chỉ thị sơ bộ và 15 chỉ thị khác (từ 6-20) 
6 RM1 1 6 80-89-92-105-122-125 
7 RM5 1 5 105-110-115-118-122 
8 RM6 2 4 142-150-156-165 
9 RM17 12 6 150-154-160-175-180-185 
10 RM25 8 6 128-132-134-140-142-145 
11 RM206 5 8 125-127-130-135-145-152-160-178 
12 RM215 9 5 96-100-103-106-109 
13 RM333 10 6 170-175-178-180-189-200 
14 RM3252 1 7 162-165-167-170-174-200-205 
15 RM3843 4 4 165-170-175-182 
16 RM7097 3 5 165-167-172-176-179 
17 R4M13 4 4 172-188-200-218 
18 MADS3 6 4 192-222-238-246 
19 SO1160 1 4 170-175-187-210 
20 S11033 11 6 162-165-170-175-178-180 
C Bộ chỉ thị mở rộng: 10 chỉ thị 
21 RM19 12 5 190-202-210-225-227 
22 RM223 8 5 152-154-160-165-172 
23 RM341 2 7 156-160-166-166-175-192-206 
24 RM3486 5 6 215-221-225-230-250-253 
25 RM5758 10 5 96-100-103-106-109 
26 RM10825 1 4 82-87-92-100 
27 RM17954 5 7 150-162-167-170-175-180-184-195-200 
28 RM26063 11 6 112-122-130-134-138-143 
29 MADS8 1 3 150-175-200 
30 EST20 11 4 187-196-213-218 
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 
254 
Tổng số các alen của chỉ thị tham chiếu 
chính thức là 120 alen. Nếu sử dụng 20 chỉ thị 
của bộ chỉ thị tham chiếu chính thức, ta sẽ phân 
biệt được 1,32434 1015 mẫu giống khác nhau 
bởi ít nhất 1 cặp alen. Nếu tính thêm cả bộ chỉ thị 
mở rộng ta sẽ có 172 alen, kích thước từ 80-253 bp. 
Khi đó nếu sử dụng cả 30 chỉ thị trên thì sẽ phân 
biệt được 1,40169 1022 mẫu giống khác nhau 
bởi ít nhất 1 cặp alen. 
Số lượng các alen đối với từng locut sẽ thay 
đổi tùy thuộc vào tập đoàn giống nghiên cứu. 
Trong phạm vi của đề tài, chúng tôi đã tìm và xác 
định được các alen như bảng 1. Các đồng nghiệp, 
tác giả khác khi sử dụng bộ chỉ thị này có thể tự 
cập nhật thêm số liệu. 
3.2. Thiết lập và thử nghiệm qui trình 
Quy trình được nghiên cứu xây dựng dựa 
trên nguyên tắc về sự phù hợp giữa chỉ tiêu DUS 
với sự kiểm tra chỉ thị ADN như sau: 
- Chỉ tiêu khác biệt: Phân tích một số lượng 
nhất định các locus chỉ thị ADN cho phép thử 
nghiệm kiểu gen quan tâm có khác với các kiểu 
gen đã biết trước hay không và đồng thời xác 
định khoảng cách di truyền giữa chúng. 
- Chỉ tiêu đồng nhất: Kiểu gen đồng nhất di 
truyền cần phải có phổ ADN giống nhau đối với 
từng locus chỉ thị ADN. 
- Chỉ tiêu ổn định: Hạt giống của một kiểu 
gen cụ thể thu được ở các năm khác nhau thì phải 
có phổ ADN của các locus chỉ thị ADN giống hệt 
nhau và ổn định. 
Việc thử nghiệm, xây dựng quy trình khảo 
nghiệm DUS bằng chỉ thị phân tử cũng phải phù 
hợp với các tiêu chí của khảo nghiệm DUS bằng 
hình thái và hóa sinh hiện hành, bao gồm đánh 
giá tính đồng nhất, tính khác biệt và tính ổn định. 
Đối với quy phạm khảo nghiệm DUS hiện hành, 
phương pháp chủ yếu đánh giá tính đồng nhất 
căn cứ vào tỷ lệ cây khác dạng của tất cả cây trên 
ô thí nghiệm. 
Căn cứ vào báo cáo kết quả khảo nghiệm 
DUS tại Trung tâm Khảo Kiểm nghiệm, giống 
khảo nghiệm được xem là đồng nhất nếu có từ 1-
3 cây khác dạng trong số 1000 cây thí nghiệm. 
Như vậy khi phân tích 300-500 cây của một 
giống đối với bộ chỉ thị tham chiếu, nếu chỉ phát 
hiện thấy từ 1-2 sự khác biệt về alen thì có nghĩa 
là biến động về alen trong cùng một giống tương 
đương với biến động kiểu hình. 
Để kiểm chứng và hài hòa giữa phân tích 
ADN và phân tích các tính trạng hình thái, chỉ 
tiêu sinh hóa, trong quá trình lập quy trình, đề tài 
đã tiến hành khảo sát các nhóm giống bao gồm: 
nhóm giống có trên 3 cây khác dạng/1000 cây, 
nhóm giống có từ 2-3 cây khác dạng/1000 cây; 
nhóm giống không có cây khác dạng nào. 
Mỗi nhóm giống tiến hành phân tích sự khác 
biệt về alen đối với các chỉ thị của bộ chỉ thị tham 
chiếu. Khảo sát từ 2-5 giống trong mỗi nhóm, 
mỗi giống phân tích 480 cây khác nhau để kiểm 
chứng cơ sở khoa học và phân tích bằng xác suất 
thống kê, tìm sự phù hợp giữa kiểm tra bằng kiểu 
hình và đánh giá bằng kiểu gen. Các giống lúa 
được gieo trồng theo đúng kỹ thuật đánh giá 
DUS theo thí nghiệm hàng-bông tại Trung tâm 
Khảo nghiệm: Chọn ngẫu nhiên 50 bông trong số 
100 bông tác giả gửi đến. Mỗi bông cấy 2 hàng 
(2 lần nhắc lại), hàng cách hàng 20cm, cây cách 
cây 15cm, mỗi hàng 25 cây. 
Kết quả khảo sát 480 cây của mỗi giống cho 
thấy, nhóm giống có trên 3 cây khác dạng/1000 
cây có sự sai khác về alen rất lớn khi khảo sát với 
các chỉ thị của bộ chỉ thị tham chiếu (từ 30-60 
cây đối với 5-10 chỉ thị). Điều này được ghi nhận 
trên 480 cây của giống Nếp Nhiệt đới và giống 
Hương thơm số 1. Phân tích các chỉ tiêu DUS 
năm 2012 cũng cho thấy hai giống này có trên 3 
cây khác dạng/1000 cây quan sát. 
Bảng 2. Danh sách các giống dùng trong thử nghiệm ADN để lập quy trình 
Nhóm Tên giống Số cây có sai khác về alen 
Basmati 370 60 
HT8 10 
Nhóm 1: Giống có nhiều hơn 3 cây khác 
dạng/1000 cây trong đánh giá các tính trạng 
hình thái Hương thơm số 1 40 
Việt thơm 8 10 Nhóm 2: Giống có ít hơn 3 cây khác dạng/1000 
cây trong đánh giá các tính trạng hình thái Nếp Nhiệt đới 15 
Nếp Lang Liêu 3 
NH92 5 
TB2 3 
Thảo dược Vĩnh Hòa 2 
Nhóm 3: Giống không có cây khác dạng/1000 
cây trong đánh giá các tính trạng hình thái 
RS 0 
Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất 
255 
Hình 1. Đánh giá các cây lúa của giống Nếp Nhiệt đới đối với chỉ thị RM3412, có 10 cây cho alen 
khác biệt với những cây khác 
A. Cây số 1-96; B. Cây số 97-192; C. Cây số 193-288; D. Cây số 289-384. E. Cây số 385-480. 
Kết quả phân tích 480 cây của từng giống 
trong nhóm giống có từ 2-3 cây khác dạng/1000 
cây cho thấy có sự sai khác về alen của 10-15 cây 
đối với 3-7 chỉ thị. Nhóm giống không có cây 
khác dạng nào cũng vẫn có từ 1-5 cây có sự sai 
khác về alen đối với 1-3 chỉ thị trong bộ chỉ thị 
đem phân tích. Như vậy là biến động về alen chỉ 
thị phân tử lớn hơn biến động kiểu hình của 
giống. Điều này có thể được giải thích như sau: 
Các chỉ thị ADN là trung tính, không nhất thiết 
liên quan đến biểu hiện kiểu hình, vì thế biến 
động alen trong cùng 1 giống lớn hơn biến động 
kiểu hình. 
Từ những kết quả trên, để phù hợp với tiêu 
chuẩn khảo nghiệm tính đồng nhất trong khảo 
nghiệm DUS, với độ nhậy = 0,80 đến 0,90 và α = 
0,05; nghiên cứu cần tối thiểu 50 đối tượng để 
ước tính R2 ≥ 0,23; hay tối thiểu 100 để ước tính 
R2 ≥ 0,12. 
Khi khảo sát các giống trong quá trình thử 
nghiệm phương pháp, từ kết quả 261 giống thử 
nghiệm ban đầu, đến những giống có từ nhiều 
đến không có cây khác dạng trong phân tích 
ADN đối với các chỉ thị của bộ chỉ thị tham 
chiếu, kết quả thực nghiệm đã chứng tỏ mức độ 
khác biệt bên trong của cùng một giống tối đa là 
5 nhóm. Đối với 5 chỉ thị chọn ra dùng cho bộ 
chỉ thị sơ bộ, kết luận này đạt độ tin cậy ở mức α 
= 0,05 tương ứng với quy định trong quy phạm 
khảo nghiệm. 
Kết luận này cũng tương tự như kết luận của 
các nhà khoa học Ucraina khi đưa ra các nguyên 
tắc để xác định tính đồng nhất và độ khác biệt 
bên trong của một giống đối với cây lúa mì. 
3.3. Quy trình xác định giống lúa thuần bằng 
sinh học phân tử hỗ trợ cho khảo nghiệm DUS 
* Phạm vi áp dụng 
Áp dụng tại các cơ sở có điều kiện về cơ sở 
vật chất, nguồn nhân lực và được sự cho phép 
của Nhà nước. 
* Đối tượng áp dụng 
Quy trình này áp dụng cho các giống lúa 
thuần nhằm hỗ trợ cho công tác khảo nghiệm 
DUS một cách chính xác và hiệu quả hơn. 
* Các bước của quy trình 
Bước 1: Xác định độ đồng nhất của giống 
1. Tách chiết ADN tổng số của 50 cây/giống 
2. Làm phản ứng PCR với 5 chỉ thị của bộ 
chỉ thị đánh giá sơ bộ RM11, RM21, RM163, 
RM481, RM3412. 
3. Điện di sản phẩm của phản ứng PCR trên 
gel polyacrylamide 4,5% hoặc 6% - 10% với 
ladder 25bp hoặc 50bp kèm theo 
4. Ghi nhận kết quả. 
5. Phân tích kết quả: Giống đồng nhất khi 
các cá thể có sự đồng nhất về alen đối với cả 5 
chỉ thị nghiên cứu. 
Bước 2. Kiểm tra độ khác biệt bên trong của 
giống 
1. Khi giống không đồng nhất về alen ở bước 1, 
chia mẫu thành các nhóm có các thành phần alen 
khác nhau. 
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 
256 
2. Phân tích ADN của một mẫu đối với từng 
nhóm, sử dụng 15 chỉ thị còn lại của bộ chỉ thị 
tham chiếu (RM1, RM5, RM6, RM17, RM25, 
RM206, RM215, RM333, RM3252, RM3843, 
RM7097, R4M13, MADS3, SO1160, S11033). 
3. Phân tích kết quả: Tổng hợp kết quả khảo 
sát đối với cả 20 chỉ thị của bộ chỉ thị tham chiếu, 
số nhóm tối đa chỉ có thể là 5. Nếu nhiều hơn 5 
nhóm thì được xem là không đồng nhất. 
Bước 3. Kiểm tra độ ổn định của giống 
1. Tách chiết ADN tổng số của 30 cây đối 
với cây lúa gieo từ hạt giống của ba vụ liên tiếp 
2. Làm phản ứng PCR với ADN của 30 cây 
trên đối với 5 chỉ thị của bộ chỉ thị tham chiếu. 
3. Điện di sản phẩm của phản ứng PCR trên 
gel polyacrylamide 4,5% hoặc 6% - 10% với 
ladder 25bp hoặc 50bp kèm theo 
4. Ghi nhận kết quả. 
5. Phân tích kết quả: Giống ổn định: các cá 
thể có sự đồng nhất về alen đối với cả 5 chỉ thị 
của bộ chỉ thị tham chiếu. 
Bước 4. Kiểm tra sự khác biệt của giống 
1. Phân tích thành phần alen của giống mới 
được tiến hành với 1 trong số 50 cây đã kiểm tra 
ở bước 1, chọn ngẫu nhiên 1 cây. 
2. Làm phản ứng PCR với ADN của 1 
cây/giống trên đối với toàn bộ các chỉ thị của bộ 
chỉ thị tham chiếu chính thức (20 chỉ thị). 
3. Điện di sản phẩm của phản ứng PCR trên 
gel polyacrylamide 4,5% hoặc 6% - 10% với 
ladder 25bp hoặc 50bp kèm theo. 
4. Ghi nhận kết quả. 
5. Phân tích kết quả: 
- So sánh thành phần alen của giống mới với 
các giống đã có trong phần mềm DUS-DFP. Nếu 
giống mới có nhận dạng ADN (DNA fingerprint) 
không tương đồng với bất kỳ một giống nào đã 
có trong thư viện quá 95% có thể xem đó là 
giống mới. 
- Nếu giống có nhận dạng ADN tương đồng 
với bất kỳ một giống nào đã có trong thư viện 
quá 95% cần phải so sánh hai giống đó với nhau 
sử dụng cả 30 chỉ thị của bộ chỉ thị chính thức và 
mở rộng (RM19, RM223, RM341, RM3486, 
RM5758, RM10825, RM17954, RM26063, 
MADS8, EST20). Giống mới là giống có phổ 
ADN khác hoàn toàn với các giống đã được lưu 
giữ trong thư viện bởi ít nhất một trong số các chỉ 
thị của bộ chỉ thị tham chiếu chính thức và một 
trong số các chỉ thị của bộ chỉ thị mở rộng. 
Bước 5. Kết luận chung 
Giống mới được công nhận khi đạt tất cả các 
yêu cầu trong các bước kiểm tra nêu ở trên. Kết 
luận cuối cùng phải đi kèm với kết quả đánh giá 
so sánh về mặt hình thái (65 tính trạng) theo quy 
định của Nhà nước. 
* Trường hợp đặc biệt: 
A - Đánh giá từ 2 giống giống nhau về các 
chỉ tiêu DUS hình thái 
1. Lấy mẫu lá 5 cây của giống cần kiểm tra 
theo phương pháp đánh dấu đường chéo 5 điểm 
trên ruộng, mỗi cây lấy 1 lá. 
2. Tách chiết ADN tổng số của 5 cây/mẫu 
giống. Trộn mẫu lá của 5 cây theo tỉ lệ cân bằng 
về nồng độ để được một mẫu ADN. 
3. Làm phản ứng PCR của ADN các mẫu 
giống trên đối với tất cả các chỉ thị của bộ chỉ thị 
tham chiếu chính thức (20 chỉ thị) và mở rộng 
(10 chỉ thị). 
4. Điện di sản phẩm của phản ứng PCR trên 
gel polyacrylamide 4,5% hoặc 6% - 10% với 
ladder 25bp hoặc 50bp kèm theo. 
5. Ghi nhận kết quả. 
6. Phân tích kết quả: Nếu nhận dạng ADN 
của các giống được kiểm tra khác biệt hoàn toàn 
đối với 3/30 chỉ thị đã sử dụng (khác biệt về alen 
và nhiễm sắc thể). Có thể xem các giống đó có sự 
khác biệt hoàn toàn. 
B - Một giống khác biệt với giống gốc bởi 1-
2 tính trạng đặc biệt 
1. Đánh giá DUS giống gốc và giống mới 
2. Phân tích hai giống bằng 30 chỉ thị của bộ 
chỉ thị chính thức và mở rộng. 
3. Xác định tính trạng mới bằng phân tích 
kiểu hình. 
4. Xác định tính trạng mới bằng phân tích 
kiểu gen thông qua chỉ thị phân tử đặc thù cho 
tính trạng mới. 
5. Phân tích kết quả: Giống mới được công 
nhận khi có sự khác biệt cả về kiểu gen lẫn kiểu 
hình đối với tính trạng mới. 
3.4. Lập ngân hàng dữ liệu cho các giống lúa 
trồng phổ biến và giống địa phương 
Phiên bản phần mềm DUS-DFP để quản lý 
ngân hàng dữ liệu sinh học phân tử và phân biệt 
giống cây trồng dưới dạng ký hiệu hiển thị ở kích 
thước alen đối với mỗi locus của chỉ thị/giống đã 
Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất 
257 
được xây dựng. Khi phân tích ADN của một 
giống mới, dữ liệu về ADN truy vấn sẽ được 
nhập vào thư viện cơ sở dữ liệu ADN đã lập sẵn 
của 180 giống lúa với tất cả các chỉ thị trong bộ 
chỉ thị tham chiếu có sẵn trong phần mềm DUS-
DFP. Phương pháp thống kê đa chiều sẽ được sử 
dụng trong phần mềm để phân tích cho ra ma trận 
khoảng cách di truyền hoặc độ tương đồng giữa 
các giống. 
Đề tài đã sử dụng bộ chỉ thị tham chiếu để 
lập cơ sở dữ liệu của 180 giống lúa. Cơ sở dữ liệu 
đã được ký hiệu hóa và nhập vào phần mềm 
DUS-DFP để sử dụng. 
Hình 2. Ảnh điện di trên gel polyacrylamide 8% của 48 giống lúa với locus RM6 
(L): ladder chuẩn 25bp; trên ảnh là các băng tương ứng kích thước 150bp, 175bp và 200bp 
Dòng cuối ký hiệu alen 1: 142bp; alen 2: 150bp; alen 3: 156p; alen 4: 160bp. 
Tất cả kết quả điện di của 180 giống với 
từng chỉ thị của bộ chỉ thị tham chiếu chính thức 
và mở rộng đã được nhập vào phần mềm DUS-
DFP 4.1. 
IV. KẾT LUẬN 
4.1. Kết luận 
- Đã thu thập được 261 dòng/giống lúa. 
- Đã sử dụng 557 chỉ thị ADN để khảo sát 
lựa chọn ra bộ chỉ thị tham chiếu bao gồm các chỉ 
thị sau: 
1). Bộ chỉ thị đánh giá sơ bộ (5 chỉ thị): 
RM11, RM21, RM163, RM481, RM3412 
2). Bộ chỉ thị chuẩn (20 chỉ thị): Gồm 5 chỉ 
thị trên: RM11, RM21, RM163, RM481, 
RM3412 và 15 chỉ thị khác: RM1, RM5, RM6, 
RM17, RM25, RM206, RM215, RM333, 
RM3252, RM3843, RM7097, R4M13, MADS3, 
SO1160, S11033. 
3). Bộ chỉ thị mở rộng (10 chỉ thị): RM19, 
RM223, RM341, RM3486, RM5758, RM10825, 
RM17954, RM26063, MADS8, EST20. 
- Đã nghiên cứu, xây dựng quy trình “Xác 
định giống lúa thuần bằng sinh học phân tử hỗ trợ 
cho khảo nghiệm DUS” phù hợp với các tiêu chí 
và tiêu chuẩn đánh giá trong công tác khảo 
nghiệm DUS hiện hành. 
- Đã nghiên cứu xây dựng phần mềm 
DUS-DFP để lưu trữ thư viện nhận dạng ADN 
(DNA fingerprinting), phân tích và hỗ trợ trong 
khảo nghiệm DUS. 
- Đã lập cơ sở dữ liệu của 180 giống lúa đối 
với các chỉ thị của bộ chỉ thị tham chiếu. 
4.2. Đề nghị 
“Quy trình xác định giống lúa thuần bằng 
sinh học phân tử hỗ trợ cho khảo nghiệm DUS” 
với mục đích cung cấp phương tiện để phục vụ 
cho công tác quản lý giống trong thực tại hiện 
nay. Đề nghị đưa quy trình vào áp dụng như một 
bước trong cho công tác khảo nghiệm giống lúa ở 
Việt Nam. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. Bonow S., Von Pinho E.V.R., Vieira M.G.C., 
Vosman B. (2009). Microsatellite markers in and 
around rice genes: applications in variety 
identification and DUS testing. Crop Sci., vol. 49, 
pp.880-886. 
2. Сиволап Ю.М., Волкодав В.В., Бальвинская 
М.С., Кожухова Н.Е., Солоденко А.С. (2004). 
Идентификация и регистрация генотипов мягкой 
пшеницы (Triticum aestivum L.), ячменя (Ноrdеum 
vulgаrе L.), кукурузы (Zеа mауs L.), 
подсолнечника (Неlіапthus аnnuus L.) с помощью 
анализа микросателитных маркepов. 
Методические рекомендации - Pешения Ученых 
Советов Южного биотехнологического центра в 
растениеводстве УААН и МОНУ; Селекционно-
генетического института Национального центра 
семеноводчества и сортоизучения УААН; 
Института экспертизы сортов растений 
Госслужбы по охране прав на сорта растений 
Минагрополитики Украины. 17 trang. 
3. Deniken (2005). Molecular markers and DUS 
testing, UPOV current situation. Report of Proc. of 
Seminar on the Use of Molecular Techniques for 
Plant Variety Protection, Ottawa, ON, Canada, 16-
17 June 2005. Canadian Food Inspection Agency, 
Ottawa, ON, Canada. 
4. Michael and Simon (2006). PCR- Second Edition. 
MPG BOOKS Limited, Bodmin, Cornwall, UK. 
305pages.