Ứng dụng kỹ thuật FISH (Fluorescent in situ hybridization) trong chẩn đoán đột biến gen elastin gây hội chứng Williams‐Beuren

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013  Nghiên cứu Y học
Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 25
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT FISH (FLUORESCENT IN SITU 
HYBRIDIZATION) TRONG CHẨN ĐOÁN ĐỘT BIẾN GEN ELASTIN  
GÂY HỘI CHỨNG WILLIAMS‐BEUREN  
 Nguyễn Thị Băng Sương* 
TÓM TẮT 
Mở đầu: Hội chứng Williams‐Beuren (WBS) là bệnh di truyền trội do đột biến mất đoạn gen Elastin nằm ở 
locus 7q11.23 trên trên nhiễm sắc thể số 7. Hội chứng gây ra nhiều tổn thương, đặc biệt là ở hệ tim mạch. Chẩn 
đoán xác định bệnh có ý nghĩa quan trọng trong tiên lượng các dị tật cũng như định hướng điều trị cho bệnh 
nhân. Ở Việt Nam, việc ứng dụng phương pháp sinh học phân tử trong chẩn đoán xác định WBS còn rất hạn 
chế. 
Mục tiêu: Chẩn đoán đột biến gene elastin (ELN) gây hội chứng Williams bằng kỹ thuật FISH. 
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Những bệnh nhân được chẩn đoán Williams‐Beuren trên lâm 
sàng với vẻ mặt điển hình và các tổn thương tim mạch đặc hiệu cũng như đã có kết quả dương tính với phản 
ứng MLPA. Tiến hành kỹ thuật FISH để xây dựng quy trình.   
Kết quả: Tất cả các bệnh nhân đều dương tính với phản ứng FISH.  
Kết luận: Như vậy kỹ thuật FISH là phương pháp sinh học phân tử có thể ứng dụng trong chẩn đoán xác 
định WBS ở Việt Nam. 
Từ khóa: 7q11.23, FISH, MLPA, vi mất đoạn, Williams‐Beuren. 
ABSTRACT 
APPLICATION OF FLUORESCENT IN SITU HYBRIDIZATION FOR DIAGNOSIS OF MUTATIONS 
IN ELASTIN GENE WHICH CAUSE WILLIAMS‐BEUREN SYNDROME 
Nguyen Thi Bang Suong * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ Supplement of No 4 ‐ 2013: 24 ‐ 28 
Introduction: Williams‐Beuren syndrome (WBS) is the dominant genetic disease caused by a mutation in 
Elastin gene which  locates  in 7q11.23  of  region  on  chromosome 7. Most  of mutations  is deletion. Syndrome 
caused many injuries, especially in the cardiovascular system. In many countries, FISH has been used for genetic 
diagnosis of William‐Beuren syndrome. 
Objectives: Diagnosis of mutations in Elastin gene by fluorescent in situ hybridization technique.  
Patients  and methods:  Five patients were diagnosed William‐Beuren based on  clinical and  subclinical 
diagnostic results. In addition, DNA of all these patients were analysed by multiplex ligation‐dependent probe 
applification technique and we found that their Elastin gene were deleted. Design FISH procedure to diagnose 
William‐Beuren syndrome. 
Results: All five patients were positive with FISH reaction, their Elastin gene showed mutations. 
Conclusions: We have successfully applied the FISH technique for the diagnosis of William-Beuren 
syndrome. 
Keywords: 7q11.23, FISH, MLPA, deletion, Williams‐Beuren. 
ĐẶT VẤN ĐỀ 
Sự  mất  đoạn  có  kích  thước  từ  1,55  đến 
1,85Mb  trên nhiễm  sắc  thể  số 7,  liên quan  đến 
26‐28 gene,  được  cho  là nguyên nhân gây nên 
* Đại học Y Dược TP.HCM  
Tác giả liên lạc: TS.BS. Nguyễn Thị Băng Sương,   ĐT: 0914007038,   Email: suongnguyenmd@gmail.com. 
Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013
Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học  26
hội  chứng  Williams‐Beuren  (WBS,  Williams‐
Beuren  syndrome). Ước  tính  trên  thế giới  tỷ  lệ 
mắc  bệnh  là  1/10000  ca  sinh,  trong  đó  sự mất 
đoạn 1,55Mb chiếm phần  lớn. Gen Elastin, nằm 
giữa vùng mất  đoạn,  có vai  trò  rất quan  trọng 
trong chức năng của cơ thể. Sự đột biến làm mất 
đi gene này gây ra các dị tật đặc trưng nhất của 
hội  chứng Williams‐Beuren  như  hẹp  trên  van 
động mạch  chủ, hẹp  động mạch phổi ngoại vi 
hay bất thường của động mạch nuôi cơ(2,12,13). 
Trên thế giới, đã có nhiều nghiên cứu về đột 
biến gene gây nên hội chứng WBS và phát triển 
các phương pháp  chẩn  đoán  sinh học phân  tử 
khác nhau, mỗi phương pháp có các ưu nhược 
điểm khác nhau(6,10,12).  
Ở  Việt  Nam,  những  nghiên  cứu  trên  hội 
chứng WBS vẫn  còn hạn  chế. Hiện nay  tại  các 
trung  tâm phẫu  thuật  tim mạch  trong  cả nước 
nói  chung  và  tại  thành  phố Hồ Chí Minh  nói 
riêng,  bệnh  nhân  được  chẩn  đoán  hội  chứng 
Williams chỉ dựa vào các đặc điểm hình thể đặc 
trưng, nhất là khuôn mặt gợi ý, tính cách cởi mở 
và  đặc  biệt  là  tổn  thương  hẹp  trên  van  động 
mạch  chủ  và/hoặc  hẹp  động  mạch  phổi  chứ 
chưa có chẩn đoán phân tử chính xác. Mặc khác, 
những  trẻ  em mắc hội  chứng Williams  nhưng 
không có biểu hiện tim mạch thì hầu như bị bỏ 
sót  chẩn  đoán.  Việc  chẩn  đoán  chính  xác  hội 
chứng  Williams  bằng  phương  pháp  sinh  học 
phân  tử  sẽ giúp nâng  cao khả năng phát hiện 
bệnh cũng như thiết lập cơ sở cho việc theo dõi 
lâu dài cũng như có những biện pháp tư vấn, hỗ 
trợ thích hợp. 
Tiêu  chuẩn  vàng  giúp  chẩn  đoán  bệnh  là 
phân  tích phát hiện đột biến gen,  trong đó đột 
biến  gen  Elastin  là  nguyên  nhân  chủ  yếu  gây 
bệnh(11). Nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã ứng 
dụng thành công quy trình chẩn đoán đột biến 
mất đoạn gen Elastin bằng kỹ thuật MLPA. Tuy 
nhiên một số tác giả cho rằng kỹ thuật FISH có 
giá trị đặc hiệu cao trong xác định đột biến gen 
Elastin. FISH  là một kỹ  thuật phân  tích nhiễm 
sắc thể sử dụng các probe gene elastin chuẩn bị 
sẵn. Nếu một bệnh nhân có hai copy ELN (mỗi 
copy nằm trên một nhiễm sắc thể số 7) thì người 
này  không mắc  hội  chứng Williams. Nếu một 
người chỉ có một copy ELN thì được chẩn đoán 
mắc  hội  chứng  này.  Gần  như  tất  cả  (98‐99%) 
bệnh nhân mắc hội chứng Williams có mất đoạn 
gene ELN cùng với 26 gene khác(4). 
Một khi  tuổi  thọ bệnh nhân mắc hội chứng 
Williams được tăng lên thì khả năng kết hôn và 
sinh  con  có  thể  xảy  ra. Trong  trường hợp này 
chẩn đoán xác định bằng phương pháp phân tủ 
sẽ  tạo  điều kiện  cho  tư vấn di  truyền và  chẩn 
đoán  trước  sinh. Xuất phát  từ nhu  cầu  thực  tế 
trên,  chúng  tôi  tiến  hành  đề  tài  “Ứng  dụng  kỹ 
thuật  FISH  (Fluorescence  In  Situ  Hybridization) 
trong chẩn đoán đột biến gene elastin (ELN) gây hội 
chứng Williams” 
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 
Đối tượng nghiên cứu 
Nhóm chứng 
10  nam  và  10  nữ  bình  thường,  tiền  sử  gia 
đình không có ai mắc bệnh di truyền. 
Nhóm nghiên cứu 
5  bệnh  nhân  (2  nam  và  3  nữ)  được  chẩn 
đoán mắc phải hội chứng Williams‐Beuren dựa 
vào các  triệu chứng  lâm sàng, cận  lâm sàng và 
đã  được  xác  định  có  đột  biến mất  đoạn  gen 
Elastin bằng kỹ thuật MLPA. 
Phương pháp nghiên cứu 
Lấy mẫu xét nghiệm 
Lấy 5 ml máu ngoại biên trong ống nắp xanh 
lá cây chứa heparin. Tiến hành ly tâm thu bạch 
cầu,  trữ  trong dung dịch  fixative  (3 methanol:1 
acid acetic)  
Tiến hành kỹ thuật FISH  
Quy trình FISH được thực hiện theo hướng 
dẫn của kit Vysis (Abbott). Theo đó các mẫu dò 
và mẫu được biến tính ở 73oC trong 5 phút và lai 
qua  đêm  ở 37oC. Sau bước  rửa, DAPI  được  sử 
dụng như màu nền. Mẫu sẽ được quan sát dưới 
kính hiển vi huỳnh quang Leika DM2000. Hiện 
nay,  theo  hãng  sản  xuất,  các  probe  và  màu 
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013  Nghiên cứu Y học
Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 27
tương ứng được sử dụng là: WS ‐ LSI ELN (màu 
cam)/ LSI D7S486, D7S522 (màu xanh lá).  
Xử lý mẫu 
Nhược  trương  tế bào bằng dung dịch KCL 
0,56%. 
Cố định tế bào bằng dung dịch Carnoy. 
Nhỏ  cặn  tế bào  lên  lam kính  sạch  đã  đánh 
dấu sẵn vùng lai. 
Biến  tính DNA  đích  bằng  dung  dịch  biến 
tính Formamide 70%/2X SSC. 
Khử dung dịch biến tính bằng cồn 70%, 85%, 
100%. 
Tiến hành phản ứng lai giữa DNA dò với DNA 
đích và rửa sau lai 
Nhỏ 3 μl DNA dò lên vùng vừa lai đã được 
đánh dấu. 
Đậy  lá kính mỏng  lên vùng vừa  lai và dán 
viền xung quanh bằng dung kịch keo. 
Ủ tiêu bản ở 37°C qua đêm. 
Bỏ lá kính mỏng và lớp keo dán ra khỏi tiêu 
bản. 
Lần  lượt  rửa  tiêu bản  trong hai dung dịch 
rửa Formamide 50%/4X SSC và 2X SSC. 
Rửa sạch bằng dung dịch PBS pH7,4. 
Nhuộm, quan sát và phân tích tiêu bản 
Nhỏ 10 μl  thuốc nhuộm DAPI  lên vùng  lai 
trên tiêu bản. Rửa bằng dung dịch PBS pH 7,4. 
Nhỏ  dung  dịch  DABCO  chống  bay  màu 
thuốc thuộm lên vùng lai, đậy lá kính mỏng lên 
và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. 
Đánh giá, phân tích kết quả lai theo chỉ dẫn 
của hãng sản xuất. 
KẾT QUẢ 
Nhóm  chứng  thực  hiện  phản  ứng  FISH 
đồng thời với mẫu bệnh nhân nhằm để so sánh. 
Trong đó nhóm chứng sẽ cho kết quả có 2 vị trí 
phát tín hiệu huỳnh quang màu cam và 2 vị trí 
phát  tín hiệu huỳnh quang màu xanh  lá  (Hình 
1A). Kết quả phản  ứng FISH  của 5 bệnh nhân 
dưới dạng hình ảnh được trình bày ở hình 1B.  
Hình 1: Kết quả FISH. A: Người bình thường, có hai 
huỳnh quang màu xanh và hai huỳnh quang màu đỏ; 
B: Bệnh nhân bị đột biến mất đoạn gây hội chứng 
Williams‐Beuren, chỉ xuất hiện hai huỳnh quang 
màu xanh và một huỳnh quang màu đỏ. 
BÀN LUẬN 
Từ khi FISH ra đời, kỹ thuật này được ứng 
dụng cho chẩn đoán các bệnh liên quan đến rối 
loạn  nhiễm  sắc  thể.  So  sánh  với  các  phương 
pháp ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử khác 
như  real‐time  PCR, microsatellite,  FISH  vẫn  là 
tiêu chuẩn vàng được các phòng xét nghiệm trên 
thế giới sử dụng  làm cơ sở để kiểm chứng kết 
quả.  Mặc  dù  FISH  là  một  phương  pháp  tốn 
nhiều công  lao động, đòi hỏi  thời gian và sự  tỉ 
mỉ, không thể tự động hóa được. Thêm vào đó, 
các hóa chất sử dụng cho FISH cũng rất độc hại. 
Tuy  nhiên  về  mặt  hiệu  quả  của  xét  nghiệm, 
Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013
Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học  28
FISH có độ ổn định cao hơn so với MLPA. Đặc 
biệt  là đối với các dạng đột biến mất đoạn dài 
trên nhiễm sắc thể như ở hội chứng WBS(6,10). 
Một kỹ  thuật khác cũng được phát  triển để 
chuẩn đoán WBS  là  real‐time PCR  (hay QPCR, 
PCR  định  lượng).  Đây  cũng  được  coi  là một 
chiến lượng hay vì nguyên tắc không quá phức 
tạp,  thao  tác  cũng  đơn  giản  có  thể  tự  động 
hóa(7,14). Tuy nhiên,  thực hiện kỹ  thuật này  cần 
thiết bị hiện đại, quá trình chuẩn hóa và thiết kế 
gặp nhiều khó khăn về kỹ thuật đặc biệt là trình 
tự đặc  trưng. Bên  cạnh  đó  số  lượng phản  ứng 
cần  thiết  cho một  xét nghiệm  (thường phải  sử 
dụng nhiều cặp mồi để khuếch đại nhiều vùng 
mục  tiêu  trên  vùng Williams‐Beuren)  làm  cho 
giá thành của phương pháp này có thể tăng cao. 
Phương pháp sử dụng microsatellite cho độ 
nhạy khá cao cũng như có thể phán đoán được 
kích thước của trình tự bị mất và giá thành rẻ(5). 
Tuy nhiên phương pháp này  lại có  thể cho kết 
quả âm tính giả do chỉ kiểm tra gián tiếp sự tồn 
tại của vùng gene mục tiêu. Vì vậy có thể bỏ sót 
một số trường hợp. 
Trong nghiên  cứu,  chúng  tôi  đã  ứng dụng 
thành công kỹ thuật FISH trong chẩn đoán WBS. 
Kết  quả  của  chúng  tôi  thu  được  cho  thấy  các 
bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng rất đặc trưng, 
cũng như đã dương  tính với phản  ứng MLPA  
đều  cho  kết  quả  có  đột  biến  mất  đoạn  gen 
Elastin.  Cả  5  bệnh  nhân  tham  gia  vào  nghiên 
cứu đều cho kết quả giống nhau với mất đoạn 
gen Elastin trên một allen, đây là dạng mất đoạn 
điển hình ở các bệnh nhân WBS. Bệnh di truyền 
trội  trên nhiễm sắc  thể  thường nên chỉ cần đột 
biến  trên  1  allele  đã  biểu  hiện  kiểu  hình  đặc 
trưng  của  hội  chứng WBS.  Điều  này  phù  hợp 
với các nghiên cứu của Bayes M và Dutra RL(0, 4).  
 Kết quả FISH đối với bố và mẹ của hai bệnh 
nhân  trong  số 5 bệnh nhân  được khảo  sát  cho 
kết quả âm tính (không được hiển thị), ở cả hai 
gia  đình,  người  bố  và mẹ  đều  là  người  bình 
thường  không mang  gen  bệnh.  Như  vậy  đột 
biến  ở bệnh nhân  là  đột biến  tự phát  sinh chứ 
không phải do di  truyền  từ  bố hoặc mẹ.  Điều 
này  cũng  hoàn  toàn  hợp  lý  với  cơ  chế  gây  ra 
WBS, do sự sai hỏng trong quá trình tái tổ hợp 
tương  đồng  ở  quá  trình  giảm  phân  tạo  giao 
tử(18,12). Tuy nhiên khi những người mắc phải hội 
chứng này lớn lên, lập gia đình thì khả năng gây 
bệnh cho người con  là 50%(11). Do vậy cần phải 
chẩn đoán hội chứng WBS để có hướng điều trị 
hợp lý, tránh xảy ra trường hợp đột tử do nguy 
cơ  tim  mạch,  cũng  như  giúp  quản  lý  sự  lan 
truyền gen bệnh trong cộng đồng. 
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 
Từ những bàn luận ở trên chúng tôi kết luận 
rằng  FISH  là một  phương  pháp  cần  được  sử 
dụng làm nền tảng cho các phương pháp khác ở 
các  phòng  thí  nghiệm,  phù  hợp  với  điều  kiện 
của  Việt  Nam  trong  chẩn  đoán  các  bệnh  di 
truyền nói chung và bệnh Williams‐Beuren nói 
riêng.  
Vì  những  nghiên  cứu WBS  trên  quần  thể 
người Việt Nam  là chưa  rộng  rãi nhưng  lại  rất 
cần thiết, chúng tôi đề nghị cần có những nghiên 
cứu  lớn  hơn,  trong  đó  sử  dụng  phương  pháp 
FISH đề khảo sát là rất phù hợp. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO  
1. Bayes M, Magano LF, Rivera N, Flores R, Perez  Jurado LA 
(2003). Mutational mechanisms of Williams‐Beuren syndrome 
deletions. Am J Hum Genet, 73: 131‐51. 
2. Burn J. (1986) Williams syndrome. J Med Genet, 23: 389‐95. 
3. Deutsch  SI,  Rosse  RB,  Schwartz  BL  (2007).  Williams 
syndrome: a genetic deletion disorder presenting clues to the 
biology  of  sociability  and  clinical  challenges  of 
hypersociability. CNS Spectr, 12: 903‐7. 
4. Dutra RL, Honjo RS, Kulikowski LD, Fonseca FM, Pieri PC, 
Jehee FS, Bertola DR, Kim CA (2012). Copy number variation 
in Williams‐Beuren syndrome: suitable diagnostic strategy for 
developing countries. BMC Res Notes, 5, 13. 
5. Dutra RL, Pieri Pde C, Teixeira AC, Honjo RS, Bertola DR, 
Kim CA (2011). Detection of deletions at 7q11.23 in Williams‐
Beuren  syndrome  by  polymorphic  markers.  Clinics  (Sao 
Paulo), 66: 959‐64. 
6. Eronen M,  Peippo M,  Hiippala  A,  Raatikka M,  Arvio M, 
Johansson  R,  Kahkonen  M  (2002).  Cardiovascular 
manifestations in 75 patients with Williams syndrome. J Med 
Genet, 39: 554‐8. 
7. Howald C, Merla G, Digilio MC, Amenta S, Lyle R, Deutsch 
S,  Choudhury  U,  Bottani  A,  Antonarakis  SE,  Fryssira  H, 
Dallapiccola  B,  Reymond  A  (2006).  Two  high  throughput 
technologies  to  detect  segmental  aneuploidies  identify  new 
Williams‐Beuren syndrome patients with atypical deletions. J 
Med Genet, 43: 266‐73. 
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013  Nghiên cứu Y học
Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 29
8. Kozlowski  P,  Jasinska  AJ,  Kwiatkowski  DJ  (2008).  New 
applications  and  developments  in  the  use  of  multiplex 
ligation‐dependent  probe  amplification.  Electrophoresis,  29: 
4627‐36. 
9. Lowery MC, Morris  CA,  Ewart A,  Brothman  LJ,  Zhu  XL, 
Leonard  CO,  Carey  JC,  Keating  M,  Brothman  AR  (1995). 
Strong correlation of elastin deletions, detected by FISH, with 
Williams  syndrome:  evaluation of  235 patients. Am  J Hum 
Genet, 57: 49‐53. 
10. Merla G, Brunetti‐Pierri N, Micale L, Fusco C  (2010). Copy 
number  variants  at  Williams‐Beuren  syndrome  7q11.23 
region. Hum Genet, 128: 3‐26. 
11. Metcalfe K, Simeonov E, Beckett W, Donnai D, Tassabehji M 
(2005). Autosomal dominant  inheritance of Williams‐Beuren 
syndrome  in  a  father  and  son with  haploinsufficiency  for 
FKBP6. Clin Dysmorphol, 14: 61‐5. 
12. Pober BR (2010). Williams‐Beuren syndrome. N Engl J Med, 
362: 239‐52. 
13. Pober  BR,  Johnson  M,  Urban  Z  (2008).  Mechanisms  and 
treatment  of  cardiovascular  disease  in  Williams‐Beuren 
syndrome. J Clin Invest, 118: 1606‐15. 
14. Schubert  C,  Laccone  F  (2006). Williams‐Beuren  syndrome: 
determination  of  deletion  size  using  quantitative  real‐time 
PCR. Int J Mol Med, 18: 799‐806. 
Ngày nhận bài         29/08/2013. 
Ngày phản biện nhận xét bài báo   04/09/2013. 
Ngày bài báo được đăng:    18/10/2013