Xây dựng cây phát sinh chủng loại của loài tảo Pseudonitzschia sp.G3 được phân lập ở thành phố Hải phòng dựa trên trình tự nucleotit của đoạn gien ITS1- 5,8 S-ITS2

 68 
28(4): 68-73 Tạp chí Sinh học 12-2006 
Xây dựng cây phát sinh chủng loại của loài tảo 
Pseudonitzschia sp.G3 đ−ợc phân lập ở thành phố Hải phòng dựa 
trên trình tự nucleotit của đoạn gien ITS1- 5,8 S-ITS2 
Hoàng Thị Lan Anh, Đặng Diễm Hồng 
Viện Công nghệ sinh học 
Chu Văn Thuộc 
Viện Tài nguyên và Môi tr−ờng biển 
Hiện nay, tảo độc đang là mối quan tâm 
hàng đầu của ngành nuôi trồng thủy hải sản bởi 
những thiệt hại do chúng gây ra −ớc tính lên tới 
hàng triệu đô la Mỹ mỗi năm [3]. Nhiều loài 
tảo đã đ−ợc khẳng định là nguồn gốc sinh ra 
các độc tố đe doạ tàn phá khu hệ động thực vật 
và ảnh h−ởng nghiêm trọng tới sức khỏe của 
con ng−ời. Để giảm thiểu những tác hại do tảo 
độc gây ra, vấn đề giám sát cần đ−ợc tiến hành 
th−ờng xuyên và rộng khắp. ở n−ớc ta, việc 
nghiên cứu tảo độc mới đ−ợc tiến hành một vài 
năm gần đây. Theo thống kê của Lasen và cs. 
(2004), trong số trên 70 loài tảo có khả năng 
gây độc đ−ợc xác định phân bố ở các vùng ven 
biển Việt Nam, có 11 loài tảo silic thuộc chi 
Pseudonitzschia đã đ−ợc mô tả, trong đó 2 loài 
Pseudonitzschia pungens và P. calliantha đ−ợc 
xem là những loài chiếm −u thế, có sự tích tụ 
tiềm tàng độc tố axit domoic gây hội chứng ngộ 
độc mất trí nhớ tạm thời (ASP-amnesic shellfish 
poisoning) trong các loài động vật thân mềm hai 
mảnh vỏ [7]. Chi Pseudonitzschia bắt đầu đ−ợc 
quan tâm nhiều hơn kể từ khi phát hiện ra axit 
domoic do loài P. multiseries sinh ra làm 153 
ng−ời trên đảo Hoàng tử Edward (Canada) bị 
ngộ độc và theo con số thống kê gần đây, đã 
phát hiện trên thế giới có 10 loài thuộc chi này 
có khả năng sinh ra axit domoic, gây ảnh 
h−ởng tới hệ tiêu hóa, hệ thần kinh và có thể 
gây tử vong cho ng−ời [2, 4, 7]. Do vậy, việc 
phát hiện sự có mặt của các loài trong chi tảo 
này trong các thủy vực, để đ−a ra các biện pháp 
nhằm giảm thiểu tác hại của chúng là rất quan 
trọng. 
Hiện nay trên thế giới, trong phân loại tảo, 
các kỹ thuật sinh học phân tử nh− đọc và so 
sánh trình tự nucleotit của đoạn gien ITS1-5,8S-
ITS2 đang đ−ợc sử dụng rộng rãi trong việc 
nghiên cứu phát sinh chủng loại của tảo nói 
chung và của chi Pseudonitzschia nói riêng, bởi 
đây là vùng xảy ra nhiều biến đổi đặc tr−ng cho 
loài trong quá trình tiến hóa [1, 3, 5, 6, 8]. Với 
mẫu nghiên cứu là loài Pseudonitzschia sp.G3 
đ−ợc phân lập ở Đồ Sơn thuộc thành phố Hải 
Phòng, chúng tôi đã tiến hành định tên bằng 
ph−ơng pháp quan sát hình thái và phân tích 
trình tự nucleotit của đoạn gien ITS1-5,8S-ITS2. 
Những kết quả thu đ−ợc đã góp phần khẳng định 
vai trò của sinh học phân tử trong việc hỗ trợ 
ph−ơng pháp phân loại tảo truyền thống dựa vào 
hình thái. 
I. Ph−ơng pháp nghiên cứu 
1. Vật liệu 
- Vật mẫu của loài tảo Pseudonitzschia 
sp.G3 do Viện Tài nguyên và Môi tr−ờng biển 
Hải Phòng phân lập và cung cấp, đ−ợc nuôi cấy 
trên môi tr−ờng K có nồng độ muối 24‰, ở 
nhiệt độ 25oC để thu sinh khối cho b−ớc tách 
chiết ADN. 
- Trình tự nucleotit của đoạn gien ITS1-
5,8S-ITS2 của 12 loài thuộc chi Pseudonitzschia 
bao gồm: Pseudonitzschia pungens (Grunow ex 
P. T. Cleve) Hasle 1993 có số đăng ký tại Ngân 
hàng gien quốc tế là AY544769, Pseudonitzschia 
sp..Hobart5 (AY257851), P. australis Frenguelli 
(ay452528), P. calliantha Lundholm, Moestrup 
et Hasle 2003 (AY257857), P. cf. australis 
Frenguelli (AY559850), P. cf. subpacifica (Hasle) 
Hasle (AY257860), P. cuspidata (Hasle) Hasle 
 69 
1993 (AY257853), P. delicatissima (P. T. Cleve) 
Heiden 1928 (AY257849), P. fraudulenta (P. T. 
Cleve) Hasle (AY257840), P. galaxiae Lundholm 
et Moestrup (AY257850), P. micropora Priisholm 
et Moestrup 2002 (AY257847) và P. multiseries 
(Hasle) Hasle (AY257844) đ−ợc sử dụng để xây 
dựng cây phát sinh chủng loại. 
- TOPO Kit của hãng Invitrogen (Mỹ) 
dùng để tách dòng gien. 
2. Ph−ơng pháp 
- ADN tổng số của loài Pseudonitzschia 
sp.G3 đ−ợc tách chiết theo ph−ơng pháp của Y. 
K. Hong có cải tiến cho phù hợp với điều kiện 
của Việt Nam [5]. 
- Đoạn gien ITS1-5,8S-ITS2 đ−ợc nhân bằng 
kỹ thuật PCR từ ADN tổng số với cặp mồi: 
Pseu F: 5’-GGATCATTACCACACCGAT-
CCAAG -3’. 
PseuR: 5’-CGCAGATTCACATCCTGAG-
CTAGT- 3’. 
- Phản ứng PCR đ−ợc thực hiện với 20 àl 
hỗn hợp phản ứng chứa 1 àl ADN khuôn; 2 àl 
đệm 10X; 1,5 àl dNTP với nồng độ 2,5 mM mỗi 
loại; 0,3 àl Taq polymeraza. Chu trình nhiệt 
đ−ợc tiến hành nh− sau: 94oC-3 phút (94oC-30 
giây, 55oC-1 phút, 72oC-1 phút), lặp lại 35 chu 
kỳ; 72oC-5 phút; giữ sản phẩm ở 4oC. Sau khi 
chạy điện di để kiểm tra trên gel agaroza 0,8%, 
sản phẩm PCR đ−ợc gắn vào vectơ pCR2.1 
TOPO và đ−ợc biến nạp vào chủng vi khuẩn 
Esherichia coli DH5αT1’; cuối cùng đ−ợc nuôi 
trên môi tr−ờng chọn lọc LB có bổ sung 
ampixilin, X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-
D-galactopyranosit). ADN plasmit đ−ợc tách 
chiết và kiểm tra sự có mặt của đoạn gien ITS1-
5,8S-ITS2 [9]. 
- Trình tự nucleotit ở mẫu nghiên cứu đ−ợc 
thực hiện trên máy đọc trình tự tự động ABI 
PRISM (R) 3100-Avant Genetic Analyzer (USA) 
của Viện Công nghệ sinh học. Dựa trên ch−ơng 
trình Clustal X Multiple Sequence Alignment 
Program (version 1.81, June 2000) và DNASTAR, 
chúng tôi xây dựng cây phát sinh chủng loại của 
loài Pseudonitzschia sp.G3 thu tại Đồ Sơn, với 
trình tự nucleotit của 12 loài Pseudonitzschia đã 
đ−ợc công bố tại Ngân hàng gien quốc tế. 
II. Kết quả và thảo luận 
1. Mô tả hình thái của loài tảo Pseudo-
nitzschia sp.G3 đ−ợc phân lập tại Hải 
Phòng 
Hình 1. Chuỗi hai tế bào của loài 
Pseudonizschia sp.G3 d−ới kính hiển vi quang học 
D−ới kính hiển vi quang học, vỏ có cấu trúc 
đối xứng. Hai mép vỏ thuôn đều về hai đỉnh của 
tế bào, từ khoảng 1/4 chiều dài của tế bào; hai 
đỉnh của tế bào tròn. Chiều dài của mặt vỏ: 80 ± 
4,32, chiều rộng 2 ± 0,36 àm. Trong chuỗi các 
tế bào gối lên nhau một đoạn bằng 1/4 chiều dài 
của tế bào. Dựa trên các đặc điểm hình thái, 
mẫu Pseudonizschia sp.G3 có thể là loài P. 
pungens [7]. 
2. Nhân đoạn gien ITS1-5,8S-ITS2 từ ADN 
tổng số 
ADN tổng số đ−ợc tách chiết từ sinh khối của 
loài Pseudonitzschia sp.G3 đ−ợc đảm bảo độ tinh 
sạch và nồng độ cần thiết để dùng cho các thí 
nghiệm tiếp theo. Kết quả đ−ợc chỉ ra trên hình 2. 
Đoạn gien ITS1-5,8S-ITS2 đ−ợc nhân lên bởi 
phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu đ−ợc ký hiệu 
là Pseu F-Pseu R (cặp mồi này đ−ợc thiết kế dựa 
trên trình tự nucleotit của các loài thuộc chi 
Pseudonitzschia đã công bố tại Ngân hàng gien 
quốc tế). Theo tính toán lý thuyết, sản phẩm PCR 
sẽ có kích th−ớc khoảng 825 bp. Sản phẩm PCR 
thu đ−ợc là đặc hiệu với kích th−ớc đúng nh− tính 
toán lý thuyết (hình 3). 
 70 
Hình 2. ảnh điện di kiểm tra ADN của loài 
Pseudonitzschia sp.G3 
Cột 1: thang chuẩn của ADN có kích th−ớc 1 Kb. Cột 
2: ADN tổng số của loài Pseudonitzschia sp.G3 
Hình 3. Kết quả điện di sản phẩm PCR 
Cột 1: thang chuẩn của ADN có kích th−ớc 1 Kb. Cột 
2, 3: sản phẩm PCR với cặp mồi Pseu F-Pseu R. 
3. Tách dòng đoạn gien ITS1-5,8S-ITS2 
Sản phẩm PCR đặc hiệu đ−ợc gắn vào vectơ 
tách dòng pCR2.1 và biến nạp vào chủng vi 
khuẩn E. coli DH5α T1’. Những khuẩn lạc trắng 
mọc trên môi tr−ờng nuôi cấy có bổ sung 
ampixilin và X-gal đ−ợc chọn làm ADN khuôn 
cho phản ứng PCR-checking với cặp mồi đặc 
hiệu Pseu F và Pseu R (hình 4). Sau phản ứng 
PCR-checking, các khuẩn lạc trắng đ−ợc nghi 
ngờ có mang đoạn gien mong muốn, đ−ợc nuôi 
cấy và tách chiết ADN plasmit. Các ADN 
plasmit đ−ợc chọn và cắt kiểm tra bằng enzim 
cắt giới hạn EcoRI. Kết quả sau khi cắt thu đ−ợc 
2 băng: một băng có kích th−ớc khoảng 3,9 kb 
(kích th−ớc của vectơ gốc) và một băng có kích 
th−ớc khoảng 825 bp đã chứng tỏ đoạn gien 
mong muốn đã đ−ợc gắn thành công vào vectơ 
tách dòng pCR2.1 (hình 5). Cuối cùng, các 
dòng plasmit tái tổ hợp đ−ợc tách chiết và tinh 
sạch một l−ợng đủ lớn để dùng cho việc đọc 
trình tự nucleotit. 
Hình 4. Kết quả PCR-checking các dòng tế bào 
mang vectơ tái tổ hợp 
Cột 1-15: các dòng tế bào có mang đoạn gien ITS1-
5,8S-ITS2. Cột 16: thang chuẩn ADN có kích th−ớc 1 
kb 
Hình 5. Kết quả cắt kiểm tra ADN plasmit tái tổ 
hợp bằng enzim EcoR I. 
Cột 1-2: vectơ pCR(R) đã gắn sản phẩm PCR của đoạn 
gien ITS1-5,8S-ITS2. Cột 3: thang chuẩn ADN có 
kích th−ớc 1 kb 
4. So sánh trình tự nucleotit của đoạn gien 
ITS1-5,8S-ITS2 của các loài Pseudonitzschia 
Sau khi xác định đ−ợc trình tự nucleotit của 
đoạn gien ITS1-5,8S-ITS2 của loài Pseudo-
nitzschia sp.G3, chúng tôi đã tiến hành so sánh 
trình tự thu đ−ợc với trình tự nucleotit của đoạn 
gien ITS1-5,8S-ITS2 của 12 loài Pseudo-
nitzschia đã đ−ợc công bố tại Ngân hàng gien 
quốc tế với sự hỗ trợ của phần mềm DNASTAR 
và Clustal X nhằm định tên mẫu vật này. Trên 
hình 6, chúng tôi đ−a ra kết quả so sánh trình tự 
nucleotit của đoạn gien ITS1-5,8S-ITS2 của loài 
Pseudonitzschia sp.G3 với trình tự nucleotit của 
đoạn gien ITS1-5,8S-ITS2 của loài P. pungens 
(kết quả so sánh với 11 loài Pseudonitzschia 
khác không chỉ ra ở đây). Tỷ lệ phần trăm t−ơng 
đồng của từng cặp trình tự nucleotit của các loài 
21 kb 
1 2 
 825 bp 
 1 2 3 
825 bp 
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 M 
825 bp 
 1 2 3 
 71 
Pseudonitzschia đ−ợc thống kê d−ới dạng ma 
trận tại bảng 1. Kết quả ở bảng 1 cho thấy độ 
t−ơng đồng của đoạn gien ITS1-5,8S-ITS2 của 
các loài thuộc chi Pseudonitzschia nằm trong 
khoảng 53,1-99,6% và loài Pseudonitzschia 
sp.G3 có độ t−ơng đồng cao nhất (98,8%) với 
loài P. pungens (AY544769) và thấp nhất với 
loài P. calliantha (AY257857 ) (53,1%). 
P. sp.G3 GGATCATTACCACACCGATCCAAGATCAGTCTTCATTGTGAATCTGATTGCACTGGTCTA 
P.pungens GGATCATTACCACACCGATCCAAGATCAGTCTTCATTGTGAATCTGATTGCACTGGTCTA 
 ************************************************************ 
P.sp.G3 GTATTTTTACTAAACCGCTGCCGTCAAACTTAAACTTGCAACGCGATGATTAATTCCGCC 
P.pungens GTATTTTTACTAAACCGCTGCCGTCAAACTTAAACTTGCAACGCGATGATTAATTCCGCC 
 ************************************************************ 
P.sp.G3 TTGCTGCCATTCTTCACGATTGGTAACTGGAAAGAACCAAATGACCTAAAGCAAAAATGA 
P.pungens TTGCCGCCATTCTTCACGATTGGTAACTGGAAAAAACCAAATGACCTAAAGCAAAAATGA 
 **** **************************** ************************** 
P.sp.G3 TGCAGTGTTTCGGAGCGCTGAGCGGGCGTCTTAAGTATTAGATGCATACCAAACCGACTC 
P.pungens TGCGGTGTTTCGGAGCGCTGAGCGGGCGTCTTAAGTATTAGATGCATACCAAACCGACTC 
 *** ******************************************************** 
P.sp.G3 TATTGCTGGCACTGCACATTACACCTAATACATTACAACTTTCAGCGGTGGATGTCTAGG 
P.pungens TATTGCTGGCACTGCACATTACACCTAATACATTACAACTTTCAGCGGTGGATGTCTAGG 
 ************************************************************ 
P.sp.G3 TTCCC-ACAACGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGCGAATTGCAAGACCTC 
P.pungens TTCCCCACAATGA--AAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGCGAATTGCAAGACCTC 
 ***** **** ** ********************************************* 
P.sp.G3 GTGAATCATCAAGATTTTGAACGCACATTGCGCTTTCGGGTATTCCCGGTAGCATGCTTG 
P.pungens GTGAATCATCAAGATTTTGAACGCACATTGCGCTTTCGGGTATTCCCGGTAGCATGCTTG 
 ************************************************************ 
P.sp.G3 TCTGAGTGTCTGTGGATCCCACTCAGCGCTGGCTTCGTGCTGGCTGCTGGTATTTTGGCC 
P.pungens TCTGAGT--CTGTGGATCCCACTCAGCGCTGGCTTCGTGCTGGCTGCTGGTATTTTGGCC 
 ******* *************************************************** 
P.sp.G3 GTGACTGAATTTGTTTAGTCTCGGCTTAAGTTTTACGTTAAGTACGTGCATAGATCTAGA 
P.pungens GTGACTGAATTTGTTTAGTCTCGGCTTAAGTTTTACGTTAAGTACGTGCATAGATCTAGA 
 ************************************************************ 
P.sp.G3 AAGCTCTGCCCGTTTAGTTAAAAACACGGCGTTGACACTCTTGTCTATCTCTGGTAGGTT 
P.pungens AAGCTCTGCCCGTTTAGTTAAAAACACGGCGTTGTCACTCTTGTCTATCTCTGGTAGGTT 
 ********************************** ************************* 
P.sp.G3 TATTCGACTGGAGTTTGCTACGAGTTGTCTATAGCTGTTTTGAAACTACTGGAATGAGCG 
P.pungens TATTCAACTGGAGTTTGCTACGAGTTGTCTATAGCTGTTTTGAAACTACTGGAATGAGCG 
 ***** ****************************************************** 
P.sp.G3 CTTGTAGATCTAACTAGCTGGAAACAGTTAGTTATACAATTCCGGATCTCAGATCAAGCA 
P.pungens CTTGTAGATCTAACTAGCTGGAAACAGTTAGTTATACAATTCCGGATCTCAGATCAAGCA 
 ************************************************************ 
P.sp.G3 AGAGGACCCGCCGAATTTAAGCATATAATTAAGCGGAGGAAAAGAAACTAACTAGGATTC 
P.pungens AGAGGACACGCCGAATTTAAGCATATAATTAAGCGGAGGAAAAGAAACTAACTAGGATTC 
 ******* **************************************************** 
P.sp.G3 CCTCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGGACTAGCTCAGGATGTGAATCTGCG 
P.pungens CCTCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGGACTAGCTCAGGATGTGAATCTGCG 
 ************************************************* 
Hình 6. Kết quả so sánh trình tự nucleotit của đoạn gien ITS1-5,8S-ITS2 của loài Pseudonitzschia 
sp.G3 với trình tự nucleotit của đoạn giem ITS1-5,8S-ITS2 của loài P. pungens có mã số là 
AY544769 tại Ngân hàng gien quốc tế 
Nh− vậy, có thể thấy 11 sự sai khác trong trình 
tự nucleotit của đoạn gien ITS1-5,8S-ITS2 của loài 
Pseudonitzschia sp.G3 so với loài P. pungens nh− 
sau: C125T (đột biến thay thế C bằng T tại vị trí 
nucleotit thứ 125), A154G, G184A, C306Del (đột 
biến mất C ở vị trí 306); đột biến thêm nucleotit T, 
G, G, T ở vị trí 314, 315, 428, 429, t−ơng ứng; 
T575A; A606G và A728C. 
Mồi Pseu F 
Mồi PseuR 
 72 
Bảng 1 
Bảng thống kê tỷ lệ phần trăm t−ơng đồng (ma trận tam giác trên) và khoảng cách di truyền 
(ma trận tam giác d−ới) của đoạn gien ITS1-5,8S-ITS2 giữa các loài trong chi Pseudonitzschia 
 Tỷ lệ phần trăm t−ơng đồng 
 1 2 3 4 5 6 7 8 8 10 11 12 13 
1 79,5 99,6 76,3 77,4 80,5 80,3 77,9 84,8 81,0 77,7 76,6 79,1 1 
2 29,1 79,0 76,8 74,0 82,7 74,3 81,0 84,8 74,5 52,3 74,1 53,1 2 
3 0,1 29,2 76,8 77,7 81,2 81,1 78,4 85,2 81,4 78,0 76,6 79,4 3 
4 33,4 30,9 33,5 74,2 81,6 76,2 79,2 83,5 75,8 73,4 73,7 74,0 4 
5 28,7 33,8 28,8 35,6 84,3 76,7 82,5 74,6 61,3 75,0 95,1 60,9 5 
6 22,7 22,4 22,8 30,6 25,4 82,3 84,2 94,0 76,6 75,1 82,3 76,5 6 
7 29,5 29,2 29,6 31,0 32,4 26,2 81,0 86,1 80,3 74,9 76,7 63,7 7 
8 29,4 32,8 29,5 29,8 18,3 21,5 27,8 85,5 75,8 72,5 80,4 73,7 8 
9 22,0 19,8 22,1 27,9 23,5 7,6 23,9 19,5 77,8 76,0 71,2 77,3 9 
10 24,4 33,7 24,5 36,4 33,1 30,4 29,4 34,0 28,8 82,4 61,3 83,2 10 
11 22,4 36,4 22,5 36,0 30,4 32,7 32,6 33,6 29,6 16,4 73,4 98,8 11 
12 30,6 36,1 30,9 36,7 3,6 27,6 34,5 21,4 26,3 35,5 33,3 73,9 12 
K
h
oả
n
g 
cá
ch
 d
i 
tr
u
yề
n
13 21,4 34,7 21,6 35,0 28,8 31,1 31,4 32,2 28,0 15,8 1,0 31,9 13 
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 
Ghi chú: các loài đ−ợc đánh số theo thứ tự: 1. P. australis; 2. P. calliantha; 3. P. cf. australis; 4. P. cf. 
subpacifica; 5. P. cuspidata; 6. P. delicatissima; 7. P. fraudulenta; 8. P. galaxiae; 9. P. micropora; 10. P. 
multiseries; 11. P. pungens; 12. Pseudonitzschia sp. Hobart5; 13. Pseudonitzschia sp. G3. 
Hình 7. Cây phát sinh chủng loại của 13 loài Pseudonitzschia dựa trên việc so sánh trình tự 
nucleotit của đoạn gien ITS1-5,8S-ITS2 
Dựa vào khoảng cách di truyền và tỷ lệ % 
t−ơng đồng trình tự nucleotit của đoạn gien 
ITS1-5,8S-ITS2 của các loài Pseudonitzschia và 
bằng ch−ơng trình DNASTAR, chúng tôi đã xây 
dựng cây phát sinh chủng loại của 13 loài 
Pseudonitzschia. Cây phát sinh chủng loại đ−ợc 
chỉ ra trên hình 7 cho thấy 13 loài trong chi 
Pseudonitzschia đã chia thành 3 nhóm chính: 
nhóm 1 có một loài là P. cf. subpacifica; nhóm 
2 có 3 loài gồm: P. calliantha, P. delicatissima 
và P. micropora; nhóm 3 chia thành hai nhóm 
nhỏ, bao gồm các loài: P. galaxiae, 
Pseudonitzschia sp.Hobart5, P. cuspidata, P. 
flaudulenta, P. australis, P. cf. australis, P. 
multiseries, P. pungens và Pseudonitzschia sp. 
G3; trong đó, loài Pseudonitzschia sp.G3 có mối 
quan hệ di truyền rất gần gũi với loài P. 
pungens. Trình tự nucleotit của đoạn gien ITS1-
5,8S-ITS2 thu đ−ợc của loài Pseudonitzschia 
P. galaxiae 
Pseudonitzschia sp.Hobart5 
P. cf. subpacifica 
P. calliantha 
P. delicatissima 
P. micropora 
P. cuspidata 
P. fraudulenta 
P. australis 
P. cf. australis 
 P. multiseries 
Pseudonizschia sp.G3 
P. pungens 
 73 
sp.G3 đã đ−ợc đăng ký tại Ngân hàng gien quốc 
tế với số đăng ký đ−ợc cấp là DQ166533. 
III. Kết luận 
1. Việc phân tích trình tự nucleotit của đoạn 
gien ITS1-5,8S-ITS2 của loài Pseudonitzschia 
sp.G3 đã cho thấy loài này có quan hệ di truyền 
gần gũi với loài Pseudonitzschia pungens 
(AY544769) với độ t−ơng đồng đạt đến 98,8%. 
Kết quả thu đ−ợc cùng với kết quả trong nghiên 
cứu về đặc điểm hình thái đã cho phép chúng tôi 
kết luận loài Pseudonitzschia sp.G3 đ−ợc thu tại 
Đồ Sơn, thành phố Hải Phòng có thể là loài P. 
pungens. 
2. Trình tự nucleotit của đoạn gien ITS1-
5,8S-ITS2 của loài Pseudonitzschia sp.G3 đã 
đ−ợc đăng ký tại Ngân hàng gien quốc tế với số 
đăng ký là DQ166533. 
Tài liệu tham khảo 
1. Nguyễn Đức Bách và cs., 2003: Tạp chí 
Sinh học, 25(3): 1-4. Hà Nội. 
2. Bates S. S., 2000: J. Phycol., 36: 978- 985. 
3. Cagelost G. A. et al., 1997: Applied and 
Environmental Microbiology, 63(12): 4859-
4865. 
4. Fehling J. et al., 2004: J. Phycol., 40: 622-
630. 
5. Đặng Diễm Hồng và cs., 2003: Những vấn 
đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự 
sống: 913-916. Hội nghị Khoa học toàn 
quốc lần thứ 2 nghiên cứu cơ bản trong Sinh 
học, Nông nghiệp, Y học. Huế. 
6. Đặng Diễm Hồng và cs., 2002: Tạp chí 
Khoa học và Công nghệ, 40(số đặc biệt): 
161-167. 
7. J. Lasen and N. L. Nguyen, 2004: Opera 
Botanica 140. 
8. Nina Lundholm N. et al., 2003: Phycol., 
39: 797-813. 
9. Sambrook J. and Russell D. W., 2001: A 
Laboratory manual. Cold Spring Harbor 
Laboratory Press. 
Construction of the phylogenetic tree of Pseudonitzschia 
sp.G3 isolated from HaiPhong city basing on the nucleotide 
sequence of the ITS1-5.8S-ITS2 gene fragment 
Hoang Thi Lan Anh, Dang Diem Hong, Chu Van Thuoc 
Summary 
Some species belonging to the marine diatom genus Pseudonitzschia were recognized to have capacity to 
produce domoic acid which caused amnesic shellfish poisoning (ASP). According to the traditional 
classification, researchers have relied on the morphological characters to identify the species of the genus 
Pseudonitzschia. In addition, the morphological study of the species belonging to the genus Pseudonitzschia 
were supported by phylogenetic analyses of the nuclear- encoded internal transcribed spacer 1-5.8S and the 
internal transcibed 2 rDNA (ITS1-5.8S-ITS2). In this study, the length of the ITS1-5.8S-ITS2 gene fragment of 
Pseudonitzschia sp.G3 was estimated about 825 bp. After, this fragment was amplified from Pseudonitzschia 
sp.G3 by using genomic DNA; the PCR products have been cloned into the pCR2.1 vector and the 
recombinant plasmids were transformed into the E. coli strain DH5α T1’. The result of the cloning was 
confirmed by PCR checking method and the restriction analysis by EcoRI enzyme. By comparing the 
Pseudonitzschia sp.G3 nucleotide sequence with the published nucleotide sequences of the ITS1-5.8S-ITS2 
gene fragments of Pseudonitzschia species in Gene Bank and constructing the phylogenetic tree, the 
phylogenetic relationships between Pseudonitzschia sp.G3 and 12 other Pseudonitzschia species were 
established. Our results indicated that Pseudonitzschia sp.G3 collected in Haiphong city had close 
phylogenetic relationship with Pseudonitzschia pungens (with accession number AY544769) with 
homological coefficient of 98.8%. The obtained results in this paper allowed us to conclude that may be the 
studied Pseudonitzschia sp.G3 species was Pseudonitzschia pungens. 
Ngày nhận bài: 30-8-2005