Định lượng Ginsenoside FB1, RE, RG1 bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2013 
12 
ĐỊNH LƢỢNG GINSENOSIDE Rb1, Re, Rg1 BẰNG PHƢƠNG PHÁP 
SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO 
 Trần Quang Trung*; Trịnh Văn Lẩu**; Nguyễn Văn Bạch* 
TÓM TẮT 
Xây dựng phương pháp định lượng 3 ginsenoside Rb1, Re, Rg1 bằng sắc ký lớp mỏng hiệu năng 
cao (HPTLC) với các điều kiện: 
+ Bản mỏng: HPTLC silica gel 60F254. 
+ Hệ dung môi: chloroform/AcOEt/MeOH/H2O = 15/40/22/10. 
+ Bước sóng:  = 275 nm. 
* Từ khóa: Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao; Phương pháp định lượng ginsenoside. 
QUANTITATIVE ANALYSIS OF GINSENOSIDE Rb1, Re, Rg1 BY 
HIGH PERFORMANCE THIN LAYER CHROMATOGRAPHY 
SUMMARY 
Quantitative analysis method of ginsenoside Rb1, Re, Rg1 by high performance thin layer chromatography 
was built based on the following conditions: 
 + Thin layer: HPTLC silica gel 60F254. 
 + Solvens system: chloroform/AcOEt/MeOH/H2O = 15/40/22/10. 
 + Wavelength:  = 275 nm. 
* Key words: High performance thin layer chromatography; Ginsenoside quantitative method. 
ĐẶT VẤN ĐỀ 
Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao là một 
kỹ thuật hiện đại, nhưng còn khá mới ở 
nước ta do trang thiết bị đắt tiền. Tuy nhiên, 
độ nhạy và độ chính xác cao trong phân 
tích 
hoạt chất có trong các chế phẩm, đặc biệt 
chế phẩm có nguồn gốc dược liệu. Chúng 
tôi đã tiến hành xây dựng phương pháp này 
nhằm: Định tính và định lượng 3 ginsenoside 
Rb1, Re, Rg1. 
* Học viện Quân y 
** Viện Kiểm nghiệm Thuốc TW 
Chịu trách nhiệm nội dung khoa học: GS. TS. Nguyễn Liêm 
 PGS. TS. Nguyễn Văn Minh 
TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013 
14 
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 
NGHIÊN CỨU 
1. Vật liệu nghiên cứu. 
* Nguyên liệu, dung môi, hoá chất: 
- Chất chuẩn ginsenoside Rb1, Re, Rg1 
loại SH (hãng Chromadex, Mỹ). 
- Các dung môi, hoá chất tinh khiết PA. 
* Dụng cụ và trang thiết bị: 
- Hệ thống HPTLC của hãng DESAGA; 
bản mỏng HPTLC 10 x 10 cm; 20 x 10 cm; 
20 x 20 cm; pipet tự động 1 - 10 l, 1 - 20 l, 
100 l, 200 l, 500 l; các loại dụng cụ thuỷ 
tinh có độ chính xác thích hợp. 
2. Phƣơng pháp nghiên cứu. 
* Pha dung dịch chuẩn hỗn hợp: 
- Chuẩn hỗn hợp 1: pha dung dịch 
ginsenoside Rb1 có nồng độ 51,1875 g/ml; 
ginsenoside Re có nồng độ 20,0625 g/ml 
và ginsenoside Rg1 có nồng độ 51,475 g/ml. 
- Chuẩn hỗn hợp 2: pha dung dịch 
ginsenoside Rb1 có nồng độ 150,9375 g/ml; 
ginsenoside Re có nồng độ 40,125 g/ml và 
ginsenoside Rg1 có nồng độ 200,575 g/ml. 
 - Chuẩn hỗn hợp 3: pha dung dịch 
ginsenoside Rb1 có nồng độ 250,6875 g/ml; 
ginsenoside Re có nồng độ 60,1875 g/ml 
và ginsenoside Rg1 có nồng độ 351,45 g/ml. 
 - Chuẩn hỗn hợp 4: pha dung dịch 
ginsenoside Rb1 có nồng độ 350,4375 g/ml; 
ginsenoside Re có nồng độ 80,25 g/ml và 
ginsenoside Rg1 có nồng độ 500,55 g/ml. 
 - Chuẩn hỗn hợp 5: pha dung dịch 
ginsenoside Rb1 có nồng độ 450,1875 g/ml; 
ginsenoside Re có nồng độ 100,3125 g/ml 
và ginsenoside Rg1 có nồng độ 651,425 g/ml. 
* Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký: 
- Khảo sát và lựa chọn pha động: 
Tiến hành khảo sát quá trình tách 
ginsenoside Rb1, Re, Rg1 trong dung dịch 
chuẩn hỗn hợp với 3 hệ dung môi sau: 
chloroform/MeOH/H2O = 13/7/2 (lớp 
dưới); n-Butanol/AcOEt/H2O = 4/1/5 (lớp 
trên); chloroform/AcOEt/MeOH/H2O = 
15/40/22/10. 
Dựa vào kết quả, giá trị Rf và phổ tử 
ngoại-khả kiến trên sắc ký đồ, lựa chọn 
pha động phù hợp sao cho tách ginsenoside 
Rb1, Re, Rg1 cho các peak gọn và cân 
xứng nhất. 
* Khảo sát và lựa chọn bước sóng xác 
định ginsenoside Rb1, Re, Rg1: 
Dựa vào phổ hấp thụ tử ngoại của 
saponin khi phun thuốc thử hiện màu, tiến 
hành quét phổ UV mẫu thử và mẫu chuẩn 
ginsenoside Rb1, Re, Rg1 tại nhiều bước 
sóng trong khoảng từ 200 - 800 nm. Trên 
cơ sở phổ UV của saponin kết hợp với phổ 
của mẫu chuẩn ginsenoside Rb1, Re, Rg1 
tại nhiều bước sóng khác nhau, lựa chọn 
bước sóng sao cho cường độ tín hiệu peak 
của ginsenoside Rb1, Re, Rg1 lớn nhất. 
* Xây dựng phương pháp định lượng 
ginsenoside Rb1, Re, Rg1 bằng HPTLC: 
- Khảo sát tính thích hợp của hệ thống 
sắc ký: 
Chấm 5 lần hỗn hợp dung dịch chuẩn 
ginsenoside Rb1, Re, Rg1 lên bản mỏng đã 
chuẩn bị sẵn và tiến hành sắc ký theo điều 
kiện lựa chọn. Ghi diện tích peak thu được. 
Đánh giá độ thích hợp của hệ thống sắc ký 
trên cơ sở xác định sai số tương đối của 5 
lần chấm mẫu thử phải < 5%. 
TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013 
15 
- Khảo sát khoảng tuyến tính giữa nồng độ 
ginsenoside Rb1, Re, Rg1 với diện tích 
peak. 
Pha một dãy 5 dung dịch chuẩn có nồng 
độ biến thiên trong khoảng từ 51,1875 g/ml 
đến 450,1875 g/ml (đối với ginsenoside Rb1), 
20,0635 g/ml đến 100,3125 g/ml (đối 
với ginsenoside Re) và 51,475 g/ml đến 
651,425 g/ml (đối với ginsenoside Rg1). 
Dựa trên điều kiện sắc ký đã chọn, chấm 
lần lượt 20 l mỗi dung dịch lên bản mỏng 
đã được chuẩn bị sẵn. Ghi diện tích peak 
thu được. 
- Xác định giới hạn định tính, định lượng 
của phương pháp: 
Chấm 5 lần dung dịch chuẩn hỗn hợp 
ginsenoside Rb1, Re, Rg1 có các nồng độ 
tương ứng: 51,1875 g/ml; 20,0625 g/ml; 
51,475 g/ml lên bản mỏng đã chuẩn bị sẵn 
và tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn. 
Ghi diện tích peak thu được. 
- Khảo sát độ lặp lại của phương pháp: 
Dung dịch chuẩn hỗn hợp ginsenoside 
Rb1, Re, Rg1 trong ethanol tuyệt đối. 
Chấm hỗn hợp dung dịch chuẩn ginsenoside 
Rb1, Re, Rg1 lên bản mỏng sắc ký đã chuẩn 
bị sẵn, tiến hành sắc ký trong điều kiện đã 
chọn. Ghi diện tích peak thu được trên sắc 
đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử tương ứng. 
Đánh giá độ lặp lại trên cơ sở xác định 
độ lệch chuẩn tương đối của 5 phép thử 
song song. 
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ 
BÀN LUẬN 
1. Kết quả khảo sát và lựa chọn điều 
kiện sắc ký. 
* Kết quả khảo sát và lựa chọn bước sóng 
xác định ginsenoside Rb1, Re, Rg1: 
Hình 1: Phổ HPTLC của hỗn hợp 
(Rb1, Re, Rg1) từ 200 - 800 nm (3D). 
(Hệ dung môi: chloroform/AcOEt/MeOH/ 
H2O = 15/40/22/10). 
Trên sắc phổ thu được tại bước sóng 
275 nm, các peak tách gọn, cân xứng và 
cường độ tín hiệu của peak ginsenoside 
Rb1, Re, Rg1 lớn nhất. Vì vậy, chúng tôi 
chọn bước sóng này. 
* Kết quả khảo sát và lựa chọn pha động: 
Hình 2: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn Rb1, Re, 
Rg1 ở bước sóng 275 nm (3D). 
(Hệ dung môi: cloroform/AcOEt/MeOH/ 
H2O = 15/40/22/10). 
TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013 
16 
Kết quả khảo sát hệ dung môi cho thấy: có sự tách rõ rệt giữa các vết ginsenoside Rb1, 
Re, Rg1 trong mẫu thử và cho peak gọn. Có thể sử dụng hệ dung môi này để định tính và 
định lượng các ginsenoside. 
2. Kết quả xây dựng phƣơng pháp định lƣợng ginsenoside Rb1, Re, Rg1 bằng 
HPTLC. 
* Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký: 
Bảng 1: Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký. 
STT 
DIỆN TÍCH PEAK (AU) 
Ginsenoside Rb1 Ginsenoside Re Ginsenoside Rg1 
1 187,1300 82,5000 300,4500 
2 175,2300 79,4600 292,4900 
3 198,8100 76,8400 320,2500 
4 186,2600 74,0200 328,6200 
5 190,0300 80,0200 318,0900 
 187,4920 78,5680 311,9800 
SD 8,4638 3,2417 14,9617 
RSD% 4,5142 4,1260 4,7957 
Hệ thống có tính thích hợp tốt với độ lệch chuẩn tương đối RSD < 5%, phù hợp với yêu 
cầu của Dược điển Trung Quốc (2005), bảo đảm định tính và định lượng ginsenoside Rb1, 
Re, Rg1 trong dược liệu. 
* Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của phương pháp định lượng: 
Bảng 2: Kết quả xác định khoảng tuyến tính giữa nồng độ và diện tích peak. 
DUNG 
DỊCH 
GINSENOSIDE Rb1 GINSENOSIDE Re GINSENOSIDE Rg1 
Nồng độ 
(g/ml) 
Diện tích pic 
(AU) 
Nồng độ 
(g/ml) 
Diện tích pic 
(AU) 
Nồng độ 
(g/ml) 
Diện tích pic 
(AU) 
1 51,1875 41,5800 20,0629 14,3300 51,4750 54,3400 
2 150,9375 239,7667 40,1250 100,2433 200,5750 351,7767 
3 250,6875 411,3633 60,1875 178,8933 351,4500 636,6433 
4 350,4375 597,0800 80,2500 248,66 500,5500 952,7067 
5 450,1875 767,6867 100,3125 332,4133 651,4250 1257,9900 
Phương trình hồi quy: ginsenoside Rb1: Y1 = 1,8141X1 - 43,267; ginsenoside Re: 
Y2 = 3,9107X2 - 60,467; ginsenoside Rg1: Y3 = 2,0055X3 - 53,455. 
Hệ số tương quan r1 = 0,9997; r2 = 0,9994; r3 = 0,9998 
TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013 
17 
Kết quả trên cho thấy: trong khoảng nồng 
độ khảo sát, có sự tương quan tuyến tính 
giữa nồng độ các ginsenoside Rb1, Re và 
Rg1 với diện tích peak với hệ số tương 
quan bằng 0,9997; 0,9999 và 0,9998. Các 
khoảng tuyến tính của 3 ginsenoside Rb1, 
Re, Rg1 phù hợp để định lượng chúng. 
* Kết quả xác định giới hạn định tính, định 
lượng của phương pháp: 
Xác định giới hạn định tính (LOD) và giới 
hạn định lượng (LOQ) dựa trên đáp ứng 
của dung dịch chuẩn có nồng độ thấp nhất 
trong khoảng tuyến tính và hệ số góc của 
đường hồi quy. 
Bảng 3: Kết quả xác định độ lệch chuẩn đáp ứng của mẫu chuẩn có nồng độ 51,1875 g 
ginsenoside Rb1 trong ethanol. 
STT 1 2 3 4 5 
Diện tích peak 44,4400 39,5400 43,5400 42,2400 41,0800 
Thống kê Trung bình = 42,1680; SD = 1,9455 RSD = 4,6137 
Bảng 4: Kết quả xác định hệ số góc (a) của đường hồi quy tuyến tính giữa diện tích peak và 
nồng độ ginsenoside Rb1. 
1 0.9997 1.8141 43.2670 
Trung b×nh = 1,8073 
SD = 0,0480 
RSD = 2,6549 
2 0.9987 1.8217 32.6710 
3 0.9980 1.822 35.4880 
4 0.9991 1.7258 39.5520 
5 0.9985 1.8531 35.1450 
Giới hạn định tính và định lượng của ginsenoside Rb1 là: 3,2368 g/ml và 10,6814 g/ml. 
* Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp: 
Bảng 5: Kết quả khảo sát độ lặp lại. 
STT 
LƯỢNG 
CÂN THỬ 
(gam) 
DIỆN TÍCH PEAK (AU) HÀM LƯỢNG (%) 
Ginsenoside 
Rb1 
Ginsenoside 
Re 
Ginsenoside 
Rg1 
Ginsenoside 
Rb1 
Ginsenoside 
Re 
Ginsenoside 
Rg1 
1 1,0333 992,8900 190,2800 1437,0200 1,1055 0,1241 1,4385 
2 1,0253 954,9300 177,3400 1384,7900 1,0733 0,1186 1,3989 
3 1,0254 958,8700 180,3000 1390,8800 1,0775 0,1201 1,4047 
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2013 
 18 
(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) 
4 1,0541 1064,9000 199,4900 1533,6700 1,1590 0,1261 1,5015 
5 1,0309 977,4600 186,6400 1415,9800 1,0916 0,1226 1,4215 
1,0338 989,8100 183,8100 1432,4680 1,1014 0,1223 1,4330 
SD 44,6498 8,7309 60,2851 0,0346 0,0030 0,0413 
RSD% 4,5109 4,7499 4,2085 3,1434 2,4676 2,8822 
Kết quả khảo sát trên cho thấy: Độ lặp lại của hệ thống sắc ký phù hợp với yêu cầu phân tích 
định lượng của Dược điển Trung Quốc (2005) với RSD < 5%. 
KẾT LUẬN 
- Đã xây dựng phương pháp định lượng 3 
ginsenoside Rb1, Re, Rg1 với cỏc điều kiện sau: 
+ Bản mỏng: HPTLC silica gel 60F254. 
+ Hệ dung mụi: chloroform/AcOEt/MeOH/ 
H2O = 15/40/22/10. 
+ Bước súng:  = 275 nm. 
- Đã xacs định được tính thích hợp của hệ 
thống sắc ký HPTLC, khoảng tuyến tính, giới 
hạn định tớnh, giới hạn định lượng, độ lặp lại 
và khoảng tuyến tính của phương pháp. 
Phương pháp này có thể ứng dụng để định 
lượng các ginsenoside Rb1, Re, Rg1 trong 
nhân sâm. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. Viện Dược liệu. Cây thuốc và động vật làm 
thuốc ở Việt Nam. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ 
thuật. Tập II, 2004, tr.704-710. 
2. Viện Dược liệu. Nghiên cứu thuốc từ thảo 
dược. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật. 2006, 
tr.434-450, 493-513. 
3. Viện Kiểm nghiệm Thuốc TW. Đảm bảo chất 
lượng thuốc và một số phương phỏp kiểm nghiệm. 
2007, tr.107-120, 372-392. 
4. Kurt Randerath. Sắc ký lớp mỏng. Nhà xuất 
bản Y học. Người dịch: Nguyễn Hữu Bảy, Trần 
Trung Nam. 1974. 
5. Pharmacopoeia of the Peoples’ Republic of 
China. English Edition, Vol I. Chemical Industry 
Press, 2005, pp.205-207, 223-225. Appendix VI, 
A 38-40. 
Ngày nhận bài: 10/9/2012 
Ngày giao phản biện: 10/10/2012 
Ngày giao bản thảo in: 28/12/2012