Định lượng Mafenid Acetat trong dung dịch Mafenid Acetat 5% bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

T¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 9-2017 
 5 
ĐỊNH LƢỢNG MAFENID ACETAT TRONG DUNG DỊCH 
MAFENID ACETAT 5% BẰNG PHƢƠNG PHÁP 
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 
 Lê Thị Thu Hằng*; Nguyễn Như Lâm*; Vũ Ngọc Thắng** 
 TÓM TẮT 
Mục tiêu: xây dựng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để định lượng mafenid 
acetat trong dung dịch mafenid acetat 5%. Đối tượng và phương pháp: thẩm định phương pháp 
định lượng mafenid acetat trong dung dịch mafenid acetat 5% (chế phẩm được điều chế từ 
nguồn nguyên liệu sản xuất trong nước) với các tiêu chí: tính tương thích của hệ thống, khoảng 
tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại, giới hạn định lượng và giới hạn phát hiện theo hướng dẫn 
của USP và ICH. Kết quả: điều kiện sắc ký gồm: cột Phenomenex C18 (150 x 4,6 mm, 5 µm); 
pha động là hỗn hợp dung dịch đệm phosphat pH 2,5-acetonitril (90:10); tốc độ dòng 1,0 ml/phút; 
detector UV-VIS 267 nm. Phương pháp xây dựng được có độ đúng (% tìm lại) từ 98,32 - 99,58% 
và độ lặp lại cao (RSD% = 0,35%). Khoảng tuyến tính 0,05 - 2,0 mg/ml với hệ số tương quan r 
= 0,9999. Giới hạn phát hiện (LOD) 0,1076 µg/ml và giới hạn định lượng (LOQ) 0,3227 µg/ml. 
Kết luận: đã xây dựng được phương pháp phù hợp để định lượng mafenid acetat trong dung 
dịch mafenid acetat 5%. 
* Từ khóa: Dung dịch mafenid acetat; Thẩm định phương pháp; HPLC. 
Quantitative of Mafenid Acetate in 5% Mafenid Acetate Solution by 
High Performance Liquid Chromatography 
Summary 
Objectives: To establish the HPLC method for the quantitative of mafenide acetate in 5% mafenide 
acetate solution. Subjects and methods: Validating some parameters of the established method 
used to quantify 5% mafenide acetate solution (the products are prepared by domestic materials) 
including system suitability, specificity, linear range, precision, accuracy, the limit of detection, 
the limit of quantitation. Results: Chromatographic conditions of the method: Phenomenex C18 
(150 x 4.6 mm, 5 µm) column, phosphate buffer solution pH 2.5-acetonitrile (90:10) as mobile phase, 
monitored at 267 nm. The established method has high accuracy (average recovery ratio from 
98.50 to 99.58%) and the high precision (RSD% = 0.35%). Linear range is 0.05 - 2.0 mg/mL 
with r = 0.9999; the limit of detection was 0.1076 µg/mL, the lower limit of quantitation was 
0.3227 µg/mL. Conclusion: A suitable HPLC method for quantifying mafenide acetate in 5% mafenide 
acetate solution was validated. 
* Keywords: Mafenide acetate solution; Validation; HPLC. 
* Bệnh viện Bỏng Quốc gia 
** Viện Kiểm nghiệm, Nghiên cứu Dược và Trang thiết bị Y tế Quân đội 
Người phản hồi (Corresponding): Lê Thị Thu Hằng (lehangvb@gmail.com) 
Ngày nhận bài: 07/08/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 10/11/2017 
 Ngày bài báo được đăng: 23/11/2017 
T¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 9-2017 
 6 
ĐẶT VẤN ĐỀ 
Mafenid acetat là một sulfonamid có 
hoạt tính kháng khuẩn rộng trên các chủng 
vi khuẩn, đặc biệt là trực khuẩn mủ xanh 
[6]. Thuốc đã và đang được sử dụng có 
hiệu quả tại các trung tâm bỏng trên thế 
giới dưới dạng dung dịch hoặc dạng kem 
để điều trị nhiễm khuẩn tại chỗ do trực 
khuẩn mủ xanh và vi khuẩn đa kháng 
thuốc khác [1, 2, 5]. Hiện nay, chúng ta 
chưa sản xuất được sản phẩm này mà 
phải nhập khẩu với giá rất cao. 
Trên cơ sở đó, Viện Bỏng Quốc gia đã 
phối hợp với Trường Đại học Dược Hà 
Nội nghiên cứu tổng hợp thành công 
nguyên liệu mafenid acetat đạt tiêu chuẩn 
Dược Điển Mỹ USP 38, đồng thời Khoa 
Dược, Viện Bỏng Quốc gia Lê Hữu Trác 
đã điều chế được dung dịch mafenid 
acetat 5%. 
Hiện tại, trong các Dược điển tham 
khảo chưa có chuyên luận cho dung dịch 
mafenid acetat. Tuy nhiên, nhu cầu sử 
dụng dung dịch mafenid acetat để điều trị 
bỏng rất lớn. Vì vậy, cần phải xây dựng 
phương pháp định lượng thành phần 
hoạt chất trong chế phẩm dung dịch 
mafenid acetat phù hợp với điều kiện 
phòng thí nghiệm hiện có để phục vụ 
công tác xây dựng tiêu chuẩn chế phẩm 
nhằm kiểm soát tốt chất lượng và hiệu 
quả của chế phẩm. 
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 
NGHIÊN CỨU 
1. Vật liệu nghiên cứu. 
- Chế phẩm nghiên cứu: dung dịch 
mafenid acetat 5% được điều chế tại 
Khoa Dược, Viện Bỏng Quốc gia Lê Hữu 
Trác ngày 06/03/2017, số lô: M1. 
- Chất chuẩn: mafenid acetat (Hội đồng 
Dược điển Mỹ, số lô GOL 536, hàm lượng 
nguyên trạng 99,4%). 
- Hóa chất, dung môi: kali dihydrophosphat, 
natri hexansulfonat, axít phosphoric (Merk) 
đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích (PA); 
acetonitril (Merck) đạt tiêu chuẩn tinh khiết 
dùng cho HPLC. 
- Thiết bị, dụng cụ: hệ thống phân tích 
HPLC Shimadzu 10 AVP với detector UV; 
cân phân tích Mettler Toledo độ chính xác 
0,1 mg (Thụy Sỹ); bộ lọc hút chân không 
Pall (Mỹ) Các thiết bị được hiệu chuẩn, 
kiểm định định kỳ theo quy định. 
2. Phƣơng pháp nghiên cứu. 
* Điều kiện sắc ký: qua tham khảo tài 
liệu [4] và thực nghiệm, lựa chọn điều kiện 
sắc ký gồm: 
- Cột Phenomenex C18 (150 x 4,6 mm, 
5 µm). 
- Detector UV: 267 nm. 
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút. 
- Thể tích tiêm: 20 µl. 
- Dung dịch đệm pH 2,5: hòa tan 6,8 g kali 
dihydrophosphat và 1,0 g natri hexansulfonat 
trong 1.000 ml nước, điều chỉnh pH về 
2,5 bằng axít phosphoric. 
* Pha động: hỗn hợp dung dịch đệm 
pH 2,5:acetonitril (90:10), lọc qua màng 
0,45 µm, siêu âm đuổi khí. 
T¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 9-2017 
 7 
* Phương pháp chuẩn bị mẫu: 
- Dung dịch chuẩn gốc: cân chính xác 
100 mg mafenid acetat chuẩn vào bình 
định mức 20 ml, thêm khoảng 15 ml pha 
động, lắc để hòa tan; bổ sung pha động 
vừa đủ đến vạch, lắc đều. Dung dịch có 
nồng độ mafenid acetat khoảng 5 mg/ml. 
- Dung dịch thử: pha loãng một lượng 
chế phẩm mafenid acetat 5% với pha động 
để được dung dịch có nồng độ mafenid 
acetat khoảng 0,5 mg/ml, lọc qua màng 
0,45 μm. 
* Thẩm định phương pháp phân tích: 
Theo hướng dẫn của USP và ICH với 
các tiêu chí: tính tương thích hệ thống; 
tính đặc hiệu; độ tuyến tính; độ đúng và 
độ lặp lại; giới hạn phát hiện và giới hạn 
định lượng [3, 4]. 
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 
1. Tính tƣơng thích của hệ thống. 
Từ dung dịch chuẩn gốc, pha loãng với pha động được dung dịch chuẩn mafenid 
acetat có nồng độ khoảng 0,5 mg/ml. Tiêm lặp lại 6 lần dung dịch này vào hệ thống 
sắc ký. 
Bảng 1: Tính tương thích của hệ thống sắc ký. 
TT Thời gian lƣu (phút) Diện tích píc (µAU.s) Số đĩa lý thuyết Hệ số bất đối xứng 
1 3,448 1756257 2324 1,43 
2 3,453 1764536 2346 1,45 
3 3,457 1773225 2307 1,44 
4 3,460 1762404 2355 1,44 
5 3,445 1783756 2389 1,43 
6 3,432 1779267 2400 1,42 
TB 3,449 1769908 2354 1,44 
SD 0,01 10600,74 36,04 0,01 
RSD (%) 0,29 0,60 1,53 0,73 
Độ lặp lại của diện tích píc và thời gian lưu tốt (RSD% đều < 2%), số đĩa lý thuyết 
và hệ số bất đối xứng phù hợp. Như vậy, thiết bị và điều kiện sắc ký phù hợp để phân 
tích mẫu nghiên cứu. 
T¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 9-2017 
 8 
2. Tính đặc hiệu. 
Tiêm lần lượt mẫu trắng (pha động), dung dịch chuẩn, dung dịch thử và mẫu thử 
thêm chuẩn vào hệ thống theo các điều kiện trên, thu được kết quả như sau: 
Minutes
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5
m
c
A
U
0.00
0.02
0.04
(
M
a
f
e
n
i
d
e
a
c
e
t
a
t
)
a) Sắc ký đồ mẫu trắng 
Minutes
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5
m
c
A
U
0.00
0.05
0.10
0.15
M
a
f
e
n
i
d
e
a
c
e
t
a
t
3
.
4
4
8
b) Sắc ký đồ dung dịch chuẩn 
Minutes
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5
m
c
A
U
0.00
0.05
0.10
0.15
M
a
f
e
n
i
d
e
a
c
e
t
a
t
3
.
4
6
3
c) Sắc ký đồ dung dịch thử 
Minutes
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5
m
c
A
U
0.0
0.1
0.2
0.3
M
a
f
e
n
i
d
e
a
c
e
t
a
t
3
.
3
9
5
d) Sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn 
Hình 1: Sắc ký đồ các mẫu: mẫu trắng (a); dung dịch chuẩn (b); 
dung dịch thử (c) và mẫu thử thêm chuẩn (d). 
Kết quả cho thấy trên sắc ký đồ của dung dịch thử và mẫu thử thêm chuẩn xuất 
hiện píc tương ứng với vị trí của mafenid acetat như trên sắc ký đồ của dung dịch 
chuẩn. Các píc này cân đối và riêng biệt. Trên sắc ký đồ của mẫu trắng tại vị trí tương 
ứng với mafenid acetat không thấy xuất hiện píc. Như vậy, phương pháp phân tích 
mafenid acetat xây dựng đảm bảo có tính đặc hiệu cao. 
3. Độ tuyến tính. 
Chuẩn bị các dung dịch có nồng độ mafenid acetat 0,05; 0,1; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0 và 
2,0 mg/ml. Tiêm lần lượt các dung dịch trên vào hệ thống sắc ký, ghi lại sắc đồ, vẽ đường 
hồi quy tuyến tính về sự phụ thuộc của diện tích píc vào nồng độ. 
T¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 9-2017 
 9 
Bảng 2: Phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích píc vào nồng độ mafenid acetat. 
Nồng độ (mg/ml) 0,05 0,1 0,25 0,5 0,75 1,0 2,0 
Diện tích píc (µAU.s) 140632 352340 866759 1704847 2543670 3387260 6663168 
Đường chuẩn y = ax + b y = 3334162x + 22117; r = 0,9999 
Hình 2: Đồ thị thể hiện sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích píc vào 
nồng độ mafenid acetat. 
Trong khoảng nồng độ khảo sát có sự phụ thuộc tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích 
píc vào nồng độ mafenid acetat theo phương trình y = 3334162x + 22117 với hệ số 
tương quan r = 0,9999. Kết quả này là cơ sở để lựa chọn nồng độ định lượng các hợp 
chất nghiên cứu tương ứng. 
4. Độ đúng. 
Độ đúng của phương pháp được xác định bằng cách thêm chuẩn với các mẫu 
được chuẩn bị như sau: thêm chính xác một lượng mafenid acetat chuẩn ở 3 nồng độ 
khoảng 0,25; 0,5 và 0,75 mg/ml vào dung dịch ban đầu có nồng độ khoảng 0,5 mg/ml. 
Tính nồng độ tìm lại dựa vào đường chuẩn. Độ đúng là tỷ lệ % giữa nồng độ tìm lại và 
nồng độ thêm vào. Tiến hành lặp lại 3 lần ở mỗi nồng độ. 
Bảng 3: Kết quả thẩm định độ đúng của phương pháp. 
Nồng độ thêm 
vào (mg/ml) 
Nồng độ tìm lại 
(mg/ml) 
% tìm lại 
Trung bình tìm lại 
(%) 
SD RSD (%) 
0,2499 0,2481 99,27 
98,50 1,18 1,19 0,2481 0,2411 97,15 
0,2515 0,2492 99,08 
0,4999 0,5042 100,87 
99,58 1,19 1,20 0,4963 0,4931 99,36 
0,5030 0,4955 98,51 
0,7498 0,7515 100,23 
99,32 0,82 0,82 0,7444 0,7375 99,06 
0,7545 0,7444 98,66 
Phương pháp có độ đúng cao, % tìm lại trung bình từ 98,32 - 99,58%. 
T¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 9-2017 
 10 
5. Độ lặp lại. 
Tiến hành định lượng lặp lại 6 lần của 
cùng một mẫu thử. 
Bảng 4: Kết quả thẩm định độ lặp lại 
của phương pháp. 
TT 
Diện tích píc 
(µAU.s) 
Nồng 
độ (%) 
% so với 
nhãn 
1 1652995 4,83 96,63 
2 1670254 4,88 97,64 
3 1665467 4,87 97,36 
4 1661413 4,86 97,12 
5 1660503 4,85 97,07 
6 1660455 4,85 97,06 
Trung bình 4,86 97,14 
RSD (%) 0,35 0,35 
Phương pháp định lượng có độ lặp lại 
cao với RSD = 0,35%. 
6. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới 
hạn định lƣợng (LOQ). 
LOD của phương pháp được xác định 
bằng cách tính từ độ lệch chuẩn của mẫu 
trắng và hệ số góc của phương trình hồi 
quy; LOQ được xác định bằng 3 lần LOD. 
Bảng 5: Kết quả xác định LOD và LOQ. 
TT 
Tín hiệu mẫu trắng 
(µAU.s) 
1 465 
2 493 
3 499 
4 270 
5 303 
6 295 
SD 108,69 
LOD (µg/ml) 0,1076 
LOQ (µg/ml) 0,3227 
Phương pháp có LOD và LOQ lần lượt 
là 0,1076 và 0,3227 µg/ml, thấp hơn nhiều 
so với điểm cuối cùng của đường tuyến 
tính đã khảo sát (50 µg/ml). 
7. Kết quả định lƣợng mafenid acetat 
trong dung dịch chế phẩm. 
Tiến hành định lượng mafenid acetat 
trong chế phẩm dung dịch mafenid acetat 
5% (sản xuất tại Khoa Dược, Viện Bỏng 
Quốc gia Lê Hữu Trác gồm 3 lô thuốc M1, 
M2, M3). 
Bảng 6: Kết quả định lượng dung dịch 
mafenid acetat 5%. 
Hàm lƣợng (%) mafenid acetate 
so với nhãn (n = 5) 
X ± SD 
Dung 
dịch 
5% 
Lô M1 99,51 ± 0,54 
99,30 ± 0,633 Lô M2 99,61 ± 0,35 
Lô M3 99,79 ± 0,61 
Hàm lượng mafenid acetat trung bình 
của cả 3 lô chế phẩm nồng độ 5% đạt 
99,30% so với lượng ghi trên nhãn. 
KẾT LUẬN 
Đã xây dựng được phương pháp định 
lượng mafenid acetat bằng HPLC. 
Phương pháp đã được thẩm định đầy đủ 
trên các tiêu chí. Kết quả thẩm định 
phương pháp cho thấy, phương pháp có 
tính đặc hiệu cao. Trong khoảng nồng độ 
khảo sát từ 0,05 - 2,0 mg/ml, có sự phụ 
thuộc tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích 
píc và nồng độ mafenid acetat với hệ số 
tương quan r = 0,9999. Phương pháp xây 
dựng được có độ đúng (98 - 99,58%) và 
độ lặp lại (RSD% = 0,35%) cao. Giới hạn 
phát hiện và giới hạn định lượng của 
phương pháp thấp hơn nhiều so với điểm 
T¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 9-2017 
 11 
cuối của đường tuyến tính. Phương pháp 
được áp dụng để xây dựng tiêu chuẩn cơ 
sở của dung dịch mafenid acetat 5%. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. Afshari A, Nguyen L, Kahn S.A, Summitt 
B. 2.5% mafenide acetate: A cost-effective 
alternative to the 5% solution for burn 
wounds. Journal of Burn Care & Research, 
2016, Vol 38, No 1, pp.e38-e47. 
2. Ibrahim A, Fagan S, Keaney T et al. 
A simple cost-saving measure: 2.5% mafenide 
acetate solution. Journal of Burn Care &Research, 
2014, Vol 35, No 4, pp.349-353. 
3. ICH guidelines. Q2 (R1) validation of 
analytical procedures: text and methodology. 
1996. 
4. United State Pharmacopeia 38. NF33. 
2015, p.4168. 
5. Paulson D, Eastman T, Bottini P.B. 
Activity of mafenide acetate 5% solution against 
nosocomial pathogens. Plasty. 2004, Vol 3, 
No 7,  
6. Japoni A et al. Pseudomonas aeruginosa: 
Burn infection, treatment and antibacterial 
resistance. Iranian Red Crescent Medical Journal. 
2009, Vol 11, No 3, pp.244-253.