Expression of gene encoding flavonol synthase isolating from Trung Du Xanh tea (Camellia sinensis var. macrophylla) IN E. coli

TAP CHI SINH HOC 2020, 42(1): 21–29 
DOI: 10.15625/0866-7160/v42n1.13833 
21 
EXPRESSION OF GENE ENCODING FLAVONOL SYNTHASE ISOLATING 
FROM TRUNG DU XANH TEA (Camellia sinensis var. macrophylla) IN E. coli 
Hoang Thi Thu Yen
1,*
, Vu Thi Lan
1
, Huynh Thi Thu Hue
2 
1
University of Sciences, Thai Nguyen University, Thai Nguyen, Vietnam 
2
Institute of Genome Research, VAST, Vietnam 
Received 20 May 2019, accepted 10 January 2020 
ABSTRACT 
Common flavonols in plants including quercetin, kaempferol and myricetin are synthesized from 
dihydroflavonols (dihydroquercetin-DHQ, dihydrokaempferol-DHK and dihydromyricetin-
DHM) by flavonol synthase (FLS). In tea, FLS has been shown to metabolize dihydroquercetin 
to quercetin. The FLS gene was cloned and sequenced from the cultivated tea (Camellia 
sinensis var. macrophylla) in Thai Nguyen province. In this study, we presented the results of 
optimizing and designing an expression vector for recombinant FLS (recombinant FLS-rFLS). 
The FLS gene was ligated completely to the pET32a (+) vector, then expressed in E. coli 
Rosetta1 and Rosetta2 strain. Using 1mM IPTG to induce the expression of rFLS at 37
o
C, rFLS 
was obtained with 52.83 kDa in size and existed predominantly as insoluble form. E. coli 
Rosetta1 pET32a (+)_FLS produces rFLS in the soluble fraction than E. coli Rosetta2 pET32a 
(+)_FLS. Next, E. coli Rosetta1 pET32a (+)_FLS was optimized for expression at temperatures of 
30
o
C, 23
o
C and 16
o
C (24 and 48 hours). After being induced for expression with 1mM IPTG in 
48 hours and cultured at 16
o
C, E. coli Rosetta1 strain containing pET32a (+) FLS produced the 
largest amount of rFLS in the soluble form. 
Keywords: Camelia sinensis, dihydroquercetin metabolism, flavonol synthase, recombinant 
FLS. 
Citation: Hoang Thi Thu Yen, Vu Thi Lan, Huynh Thi Thu Hue, 2020. Expression of gene encoding flavonol 
synthase isolating from trung du xanh tea (Camellia sinensis var. macrophylla) in E. coli. Tap chi Sinh hoc (Journal 
of Biology), 42(1): 21–29. https://doi.org/10.15625/0866-7160/v42n1.13833. 
*Corresponding author email: yenhtt@tnus.edu.vn 
©2020 Vietnam Academy of Science and Technology (VAST) 
TAP CHI SINH HOC 2020, 42(1): 21–29 
DOI: 10.15625/0866-7160/v42n1.13833 
22 
BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA FLAVONOL SYNTHASE PHÂN LẬP 
TỪ CHÈ TRUNG DU XANH (Camellia sinensis var. macrophylla) 
TRONG VI KHUẨN E. coli 
Hoàng Thị Thu Yến1,*, Vũ Thị Lan1, Huỳnh Thị Thu Huệ2 
1Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên, Thái Nguyên, Việt Nam 
2Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 
Ngày nhận bài 20-5-2019, ngày chấp nhận 10-1-2020 
TÓM TẮT 
Các flavonol phổ biến ở thực vật bao gồm quercetin, kaempferol và myricetin, được tổng hợp từ 
các dihydroflavonols (dihydroquercetin-DHQ, dihydrokaempferol-DHK và dihydromyricetin - 
DHM) bởi flavonol synthase (FLS). Ở chè, FLS được chứng minh có hoạt tính chuyển hóa 
dihydroquercetin thành quercetin. Gen FLS đã được tạo dòng và xác định trình tự từ giống chè 
trung du xanh được trồng ở Thái Nguyên. Trong nghiên cứu này, chúng tôi trình bày kết quả thiết 
kế vector và tối ưu biểu hiện FLS tái tổ hợp (recombinant FLS-rFLS). Vector pET32a(+)_FLS đã 
được tạo thành công mang cấu trúc biểu hiện FLS và được biểu hiện trong vi khuẩn E. coli 
Rosetta1 và E.coli Rosetta2. Sử dụng IPTG 1mM cảm ứng biểu hiện rFLS ở 37oC, rFLS thu được 
có kích thước 52,83 kDa, tồn tại chủ yếu ở dạng không tan. Trong đó, chủng E. coli Rosetta1 
pET32a(+)_FLS tạo rFLS biểu hiện ở dạng tan nhiều hơn chủng E. coli Rosetta2 pET32a(+)_FLS. 
Tiếp theo, chủng E. coli Rosetta1 pET32a(+)_FLS được tối ưu biểu hiện ở các nhiệt độ 30
o
C, 
23
oC và 16oC (24 và 48 giờ). Cảm ứng IPTG (1mM) sau 48 giờ nuôi ở 16oC, chủng E. coli 
Rosetta1 chứa pET32a(+)_FLS tạo rFLS lượng lớn ở pha tan. 
Từ khóa: Chè, chuyển hóa dihydroquercetin, flavonol synthase, FLS tái tổ hợp. 
*Địa chỉ liên hệ email: yenhtt@tnus.edu.vn 
MỞ ĐẦU 
Chất lượng sản phẩm chè được đánh giá 
chủ yếu dựa trên thành phần hóa học có trong 
chè. Theo Harbowy (1997), polyphenol là 
thành phần hóa học chính trong chất rắn chiết 
xuất từ chè, chiếm 30–40%. Hàm lượng 
polyphenol quyết định đến màu sắc, độ chát 
của nước chè và góp phần tạo hương vị của chè 
(Harbowy & Balentine, 1997). Hầu hết các đặc 
tính có lợi cho sức khỏe con người đã được 
chứng minh là do các hợp chất polyphenol có 
trong chè. Các hợp chất polyphenol ở thực vật 
nói chung và chè nói riêng được tổng hợp 
thông qua con đường phenylpropanoid và 
flavonoid (Czemmel et al., 2009; Kim et al., 
2014). Các hợp chất tạo ra từ con đường 
flavonoid (Flavonoid) là các chất chuyển hóa 
thứ cấp, được tạo ra ở nhiều loại thực vật, có 
vai trò quan trọng đối với sự tăng trưởng và 
sinh lý bình thường của thực vật (Pietta, 2000). 
Cho đến nay, khoảng 10.000 flavonoid khác 
nhau đã được mô tả, cấu trúc chung của chúng 
bao gồm hai vòng thơm sáu carbon (vòng A và 
B) và một dị vòng 3 carbon chứa một nguyên 
tử oxy (vòng C). Cấu trúc này có thể được thay 
đổi bằng cách sắp xếp lại, kiềm hóa, oxy hóa 
và glycosyl hóa (Turnbull et al., 2004). Sửa đổi 
vòng C tạo nên các nhóm phụ flavonoid khác 
nhau: flavones, flavonols, flavan-3-ols 
(catechins proanthocyanidins-PAs) và 
anthocyanin (Cheng et al., 2014). Đáng chú ý 
là thành phần flavonoid giữa các loài thực vật 
có thể khác nhau đáng kể, Arabidopsis không 
Expression of gene encoding flavonol synthase 
23 
chứa 5’-hydroxylated flavonoid và PAs như 
được mô tả ở các loài thực vật khác (Abrahams 
et al., 2002). Các flavonoid được chứng minh 
là có nhiều lợi ích cho sức khỏe con người như 
chống oxi hóa, kháng viêm, kháng lại tác nhân 
gây bệnh và kháng chất gây ung thư (Berger, 
2005; Vita, 2005). Con đường sinh tổng hợp 
các hợp chất flavonoid được các nhà sinh học 
và hóa học quan tâm do tầm quan trọng của 
chúng. Do đó, hầu hết các gen mã hóa các 
enzyme tham gia con đường phenylpropanoid 
và flavonoid đã được phân lập và nghiên cứu 
chức năng ở nhiều loài thực vật (Czemmel et 
al., 2009; He et al., 2018; Kim et al., 2014; 
Tohge et al., 2017; Winkel-Shirley, 2001) 
(hình1).
Phenylalanine
Cinnamic acid
4-Coumaric acid
Chalcone
4-Coumaroyl coA
PAL
C4H
4CL
CHS
Naringenin Eriodictytol
5’ hydroxyl
flavanol FLAVONE
Dihydrokaempferol Dihydroquercetin Dihydromyricetin
CHI
F3’H F3’5’H FST
F3H F3H F3H
DFR
LAR
ANS
UFGT
ANTHOCYANIN
ANR
PAs
DFR
LAR
ANS
UFGT
ANTHOCYANIN
ANR
PAs
DFR
LAR
ANS
UFGT
ANTHOCYANIN
ANR
PAs
Kaempferol Quercetin Myricetin
FLS FLS FLS
C
o
n
 đ
ư
ờ
n
g
p
h
e
n
y
lp
ro
p
a
n
o
id
F3’H F3’5’H
Con đường flavonoid
FLAVONOlS
Hình 1. Các con đường có thể sinh tổng hợp các hợp chất flavonol ở chè 
(Czemmel et al., 2009; Wang et al., 2012) 
Ghi chú: ANR (anthocyanidin reductase); ANS (anthocyanin synthase); 4CL (4-coumarate: CoA ligase); 
C4H (cinnamate 4-hydroxylase); CHI (chalcone isomerase); CHS (chalcone synthase); DFR 
(dihydroflavonol reductase); F3H (flavanone 3β-hydroxylase); F3′H (flavonoid 3′-hydroxylase); F3′5′H 
(flavonoid 3′5′-hydroxylase); FLS (flavonol synthase); FST: flavonol 4-sulfotransferase; LAR 
(leuacoanthocyanidin reductase); PAL (phenylalanine ammonialyase); proanthocyanidins – PAs; UFGT 
(UDP-glucoseflavonoid 3-O-glucosyl transferase). 
Ở nhiều loài thực vật, flavonol là thành 
phần có nhiều nhất trong các hợp chất 
flavonoid và đóng vai trò quan trọng 
(Havsteen, 2002). Flanovol quy định màu sắc, 
hương vị, chất lượng và dinh dưỡng của lá, 
hoa và quả ở thực vật, chúng có khả năng 
chống viêm, chống oxy hóa, chống đông máu 
và do đó có lợi cho sức khỏe của con người 
(Butelli et al., 2008; Havsteen, 2002). Thành 
phần flavonol ở các loài thực vật có thể bao 
gồm: quercetin, kaempferol và myricetin 
(Czemmel et al., 2009; He et al., 2018; Kim et 
al., 2014). Bằng phương pháp định lượng 
HPLC, He et al. (2018) chỉ ra ở chè có cả 3 
Hoang Thi Thu Yen et al. 
24 
loại flavonol và tồn tại dưới dạng glycosyl hóa 
(O-Glycosylated favonols) (He et al., 2018). 
Favonol là một trong hai thành phần chủ yếu 
của flavonoid ở chè (Harbowy & Balentine, 
1997) và được cho là có lợi cho một số bệnh 
mãn tính ở người (McKay & Blumberg, 
2002). Flavonols được tổng hợp từ các 
dihydroflavonol (dihydroquercetin-DHQ, 
dihydrokaempferol-DHK và 
dihydromyricetin-DHM) bởi enzyme flavonol 
synthase (FLS) (Cheng et al., 2014; Czemmel 
et al., 2009; Kim et al., 2014). Ngoài ra ở cây 
họ cải (Arabidopsis thaliana), FLS có thể 
chuyển đổi naringenin thành 
dihydrokaempferol. Hoạt tính của FLS được 
nghiên cứu lần đầu tiên ở mùi tây, hoạt động 
của FLS cần có sự tương tác với 2-
oxoglutarate và Fe (II) (Britsch et al., 1981). 
Sau đó, FLS đã được nghiên cứu cấu trúc và 
hoạt tính chức năng từ nhiều loại thực vật như 
cây dã yên (Petunia hybrida), cây cam nhật 
(Citrus unshiu), các cây trong họ cải 
(Arabidopsis thaliana; Matthiola incana), hoa 
cẩm chướng (Dianthus caryophyllus), nho 
(Vitis vinifera), chè (Camellia sinensis), ngô 
(Zea mays), bạch quả (Gingko biloba) (Cheng 
et al., 2014). 
Gen mã hóa cho FLS từ chè trồng ở Hàn 
Quốc đã được tạo dòng và nghiên cứu biểu 
hiện ở E. coli, FLS tái tổ hợp được chứng 
minh có hoạt tính chuyển hóa 
dihydroquercetin thành quercetin (Lin et al., 
2007). Chen et al. (2014) cho rằng FLS là một 
enzyme đa chức năng (Cheng et al., 2014), 
chức năng chuyển hóa các dihydroflavonol 
khác (DHQ, DHK) và naringenin của FLS ở 
chè chưa được nghiên cứu. Ở Việt Nam, gen 
mã hóa FLS từ chè Thái Nguyên, giống Trung 
du xanh và Trung du tím đã được tạo dòng và 
phân tích trình tự (Hoang Thi Thu Yen và 
nnk., 2017). Trong nghiên cứu này, chúng tôi 
nghiên cứu biểu hiện gen FLS phân lập từ 
giống chè trung du xanh trong vi khuẩn E. coli 
Rosetta để góp phần nghiên cứu làm sáng tỏ 
chức năng của FLS ở chè. 
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN 
CỨU 
Vector tạo dòng pJET1.2_FLS mang gen 
FLS phân lập từ giống chè trung du xanh và 
vector biểu hiện pET32a(+) được lưu giữ tại 
Phòng Đa dạng Sinh học hệ gen, Viện nghiên 
cứu Hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công 
nghệ Việt Nam. 
Tạo cấu trúc biểu hiện gen FLS 
Vector pJET1.2_FLS được cắt bằng hai 
enzyme giới hạn BamHI và XhoI để thu đoạn 
gen FLS có kích thước 993 bp. Đồng thời, 
phản ứng cắt bằng BamHI và XhoI cũng được 
tiến hành với vector biểu hiện pET32a(+). Sau 
đó, phản ứng lai gen FLS vào vector 
pET32a(+) sử dụng T4 ligase được tiến hành 
ở điều kiện 22oC trong 1 giờ. Sản phẩm sau đó 
được biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli 
DH10b bằng phương pháp sốc nhiệt. Khuẩn 
lạc được chọn lọc trên môi trường LB có bổ 
sung kháng sinh ampicillin (50 µg/ml). Khuẩn 
lạc chọn lọc được tiến hành nuôi và tách 
plasmid, plasmid được kiển tra bằng cắt 
enzyme giới hạn và PCR với cặp mồi đặc hiệu 
cho gen FLS (F331: 5'-
GGATCCATGGAGGTAGAGAGAG-3'; F331: 
5'-GGAGCTCTTGTGGAATCTTATTG-3'. 
Vector biểu hiện gen FLS tạo ra được kí hiệu 
là pET32a(+)_FLS. Cấu trúc vector 
pET32a(+)_FLS được mô tả như hình 2. 
Trx.tagRBS
Histag-Stag-
Thrombin-
Entorokinase
Gen FLS His tag
AUG - 108 aa 54 aa 331 aa 6 aa 5 aa - TAA
BamHI XhoI
stop
Hình 2. Mô hình cấu trúc biểu hiện gen FLS 
Ghi chú: RBS: Trình tự nhận biết của ribosome; Trx.tag giúp tăng cường protein tái tổ hợp ở dạng tan 
trong nước, Histag, Stag là trình tự giúp phát hiện và tinh chế protein tái tổ hợp, Thrombin và 
Enterokinase là trình tự giúp cắt chuỗi amino acid của protein tái tổ hợp. 
Expression of gene encoding flavonol synthase 
25 
Biểu hiện gen FLS 
Cấu trúc biểu hiện gen mã hóa FLS 
(pET32a(+)_FLS) được biến nạp vào 2 chủng 
vi khuẩn là E. coli Rosetta1 và E. coli 
Rosetta2 theo phương pháp sốc nhiệt 
(Novagen). Dịch nuôi tế bào được cấy trải 
trên đĩa LB có bổ sung kháng sinh ampicillin 
(50 g/ml), nuôi qua đêm ở điều kiện 37oC. 
Các chủng vi khuẩn được xác nhận chứa cấu 
trúc biểu hiện bằng PCR khuẩn lạc với cặp 
mồi đặc hiệu cho gen FLS (F331: 5'-
GGATCCATGGAGGTAGAGAGAG-3'; F331: 
5'-GGAGCTCTTGTGGAATCTTATTG-3'). 
Tiếp theo, cảm ứng biểu hiện gen FLS trong 
các chủng biểu hiện ở nồng độ IPTG 1mM 
dưới điều kiện 37oC trong 5 giờ, các tế bào 
được thu và xử lý trước khi kiểm tra protein 
tổng số trên gel polyacrylamide 14%. 
Tối ưu biểu hiện FLS tái tổ hợp 
Chủng E. coli Rosetta1 chứa cấu trúc biểu 
hiện pET32a(+)_FLS tạo FLS tái tổ hợp 
(recombinant FLS - rFLS) được nuôi lắc trong 
môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh 
ampicillin (50 g/ml) qua đêm. Tiếp theo, 
dịch nuôi được làm mới trong 8ml LBA 
(OD600 = 0,1). Sau 2 giờ nuôi lắc ở 37
oC, dịch 
khuẩn đạt giá trị từ OD600 = 0,6 sẽ được cảm 
ứng biểu hiện với IPTG 1mM và tiếp tục nuôi 
ở các điều kiện như sau: 37oC (5 giờ), 30oC (6 
giờ), 23oC (8 giờ) và 16oC (24 giờ và 48 giờ) 
(Jiang et al., 2013). Thí nghiệm được thực 
hiện cùng đối chứng E. coli Rosetta chứa 
pET32a(+)_FLS không cảm ứng IPTG. 
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 
Thiết kế vector biểu hiện mang gen FLS 
Vector pJET1.2_FLS được cắt bằng hai 
enzyme giới hạn BamHI và XhoI để thu đoạn 
gen FLS có kích thước 993 bp. Đồng thời, 
phản ứng cắt bằng BamHI và XhoI cũng được 
tiến hành với vector pET32a(+). Tiếp theo, 
chúng tôi thực hiện phản ứng lai gen FLS vào 
vector pET32a(+), biến nạp vào tế bào vi 
khuẩn E. coli DH10B và nuôi trên môi trường 
LB chọn lọc. Chúng tôi lựa ngẫu nhiên một số 
dòng vi khuẩn để phân tích chọn dòng vi 
khuẩn mang vector biểu hiện pET32a(+)_FLS 
bằng phản ứng cắt bằng enzyme giới hạn và 
PCR. Sản phẩm của phản ứng cắt plasmid 
bằng BamHI và XhoI được điện di kiểm tra 
trên gel agarose 0,8% (hình 3A). 
Kb M 1 2 3
1,0 
6,0 
3,0 
5,9 kb
~1,0 kb
3,0
1,0
6,0
Kb M (+) (-) 1 2 3
~ 1,0 kb
A B 
Hình 3. Kết quả điện di kiểm trả sản phẩm cắt kiểm tra plasmid pET32a(+)_FLS 
bằng enzyme giới hạn và PCR khuếch đại gen 
Hình 3A (M: maker 1kb, 1-3: sản phẩm cắt enzyme giới hạn từ 3 dòng plasmid pET32a(+)_FLS); hình 
3B (M: maker 1 kb, (+): sản phẩm PCR từ đối chứng dương là plasmid pJET1.2_ FLS, (-): sản phẩm 
PCR đối chứng âm là H2O; 1-3: sản phẩm PCR từ plasmid pET32a(+)_FLS. 
Trên hình 3A cho thấy, plasmid tách chiết 
được cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn 
BamHI và XhoI, DNA plasmid bị cắt thành 
hai đoạn: một đoạn lớn có kích thước tương 
ứng với kích thước vector pET32a(+) (5,9 kb) 
và một đoạn nhỏ hơn có kích thước khoảng 
1,0 kb tương ứng với đoạn gen FLS. Như vậy, 
chúng tôi đã tạo được vector pET32a(+) mang 
gen FLS. Đồng thời, phản ứng PCR được thực 
hiện với cặp mồi nhân gen FLS ở 3 dòng 
Hoang Thi Thu Yen et al. 
26 
plasmid đã kiểm tra bằng enzyme giới hạn. 
Sản phẩm PCR từ 3 dòng plasmid đều lên 
băng đậm và rõ nét có kích thước khoảng 1,0 
kb tương ứng với kích thước của đoạn gen 
FLS (hình 3B). Như vậy, chúng tôi đã tạo 
được dòng biến nạp vào E. coli DH10b mang 
cấu trúc biểu hiện pET32a(+)_FLS. 
Biểu hiện gen FLS trong vi khuẩn E. coli 
Hình 4. Kết quả kiểm tra sự có mặt của 
plasmid pET32a(+)_FLS trong các 
chủng E. coli biểu hiện 
M: maker 1 kb, (+): sản phẩm PCR từ đối chứng 
dương là plasmid pET32a(+)_ FLS, (-): sản phẩm 
PCR đối chứng âm là H2O; 1-2: sản phẩm PCR với 
khuôn là khuẩn lạc E. coli Rosetta1 và 2. 
FLS là một dioxygenase và thuộc siêu họ 
2OG-Fe(II) oxygenase. Enzyme này thực hiện 
chức năng chuyển hóa dihydroflavonols tạo 
flavonols thông qua domain đặc trưng của 
siêu họ 2OG-Fe(II) oxygenase. FLS chỉ có 
hoạt tính chức năng đầy đủ khi có mặt của Fe 
(II) và 2-oxoglutarate. Enzyme này thực hiện 
chức năng chuyển hóa dihydroflavonol tạo 
flavonol thông qua domain đặc trưng cho siêu 
họ 2OG-Fe(II) oxygenase bao gồm 95 amino 
acid (từ vị trí amino acid 199→291) (Britsch 
et al., 1981; Lin et al., 2007). Một số nghiên 
cứu đã chứng minh có 3 motif quyết định đến 
chức năng của FLS (Lukacin & Britsch, 
1997). Motif PxxxIRxxx-EQP ở đầu N (từ vị 
trí amino acid 18→29) quyết định đến hoạt 
tính của FLS, sự thay đổi trình tự nucleotide ở 
motif có thể làm mất hoạt tính của FLS. Motif 
CPQ/RPxLAL (205→212) là vị trí bám của 2-
oxoglutarate và vị trí amino acid liên kết với 
Fe (217H, 219D và 273H). FLS suy diễn của 
giống chè trung du xanh có motif 
CPQ/RPxLAL và motif PxxxIRxxx-EQP bảo 
thủ cao và có duy nhất một vị trí amino acid 
thay đổi so với trình tự đã công bố (19V→A) 
(Hoang Thi Thu Yen và nnk., 2017). Để tạo 
cơ sở nghiên cứu làm sáng tỏ hoạt tính của 
FLS ở chè, chúng tôi tiến hành tạo FLS tái tổ 
hợp. Sau khi thiết kế thành công, vector tái tổ 
hợp pET32a(+)_FLS được biến nạp vào 2 
chủng tế bào biểu hiện là E. coli Rosetta1 và 
E. coli Rosetta2. Tiếp theo, chúng tôi chọn 
ngẫu nhiên một khuẩn lạc từ mỗi đĩa, tiến 
hành tách plasmid và kiểm tra sự có mặt của 
pET32a(+)_FLS trong các chủng E. coli biểu 
hiện. Kết quả kiểm tra PCR gen FLS được thể 
hiện ở hình 4. 
Kết quả điện di hình 4 cho thấy, sản phẩm 
PCR khuếch đại gen FLS từ khuẩn lạc E. coli 
Rosetta1 và 2 đều lên băng đậm và rõ nét có 
kích thước khoảng 1,0 kb tương ứng với kích 
thước của đoạn gen FLS. Từ hai chủng E. coli 
Rosetta1 và Rosetta2 mang cấu trúc biểu hiện 
pET32a(+)_FLS, chúng tôi sử dụng IPTG để 
cảm ứng biểu hiện gen FLS. Kết quả kiểm tra 
protein tổng số được thể hiện ở hình 5. 
52,83 kb
Hình 5. Kết quả điện di sản phẩm protein FLS 
Ghi chú: M: thang protein chuẩn của Fermentas, 
(-): đối chứng âm là chủng không được cảm ứng, 
ts: protein tổng số, tan: protein thu được ở pha tan, 
tủa: protein thu được ở pha tủa. 
Theo tính toán lý thuyết, protein tái tổ hợp 
thu được có kích thước khoảng 52,83 kDa bao 
gồm FLS có kích thước khoảng 36,41 kDa 
cùng với đoạn trình tự TrxA mã hoá cho 
Expression of gene encoding flavonol synthase 
27 
protein thioredoxin (11,8 kDa), His-Taq (1,68 
kDa), S-Taq (1,7 kDa), thrombin (0,63 kDa) 
và enterkinase (0,61 kDa) (pET System 
Manual, Novagen). Hình ảnh điện di (hình 5) 
cho thấy, protein tổng số của các chủng E. 
coli Rosetta1, E. coli Rosetta2 có xuất hiện 
một băng protein đậm khác biệt so với đối 
chứng. Băng protein này nằm ở khoảng kích 
thước tương đương với kích thước trên lý 
thuyết của protein tái tổ hợp. Trong đó, băng 
protein ở chủng E. coli Rosetta1 to và đậm 
hơn so với chủng E. coli Rosetta2 thể hiện 
lượng protein nhiều hơn. Đồng thời chúng tôi 
cũng đánh giá độ tan của protein tái tổ hợp, 
chúng tôi nhận thấy rằng chủng biểu hiện E. 
coli Rosetta1, protein FLS biểu hiện ở dạng 
tan (pha tan) nhiều hơn ở dạng không tan (pha 
tủa – thể vùi) nhưng sự chênh lệch không quá 
lớn. Ở chủng biểu hiện E. coli Rosetta2, 
protein FLS hầu hết biểu hiện ở dạng không 
tan, chỉ một lượng nhỏ ở dạng tan. Sự khác 
biệt về sự biểu hiện FLS pha tan và tủa ở 2 hai 
chủng E. coli Rosetta1 và Rosetta2 có thể do 
sự biểu hiện của gen FLS và yếu tố tạo FLS 
pha tủa ở các chủng biểu hiện không giống 
nhau. Kết của FLS tái tổ hợp thu được cũng 
phù hợp với kết quả nghiên cứu biểu hiện gen 
FLS đã công bố (Lin et al., 2007). 
Tối ưu điều kiện nhiệt độ và thời gian để 
thu rFLS ở pha tan 
52,83 kDa
Hình 6. Tối ưu điều kiện nhiệt độ để thu 
enzyme tái tổ hợp ở pha tan 
Ghi chú: w/o IPTG: Đối chứng không cảm ứng 
IPTG, TS: protein tổng số, S: protein pha tan, P: 
protein pha tủa, M: thang chuẩn protein. 
Theo Schein và đtg (1988) (Schein & 
Noteborn, 1988), E. coli sinh trưởng và phát 
triển tốt ở 37oC. Tuy nhiên, cảm ứng biểu hiện 
ở 37°C, protein ngoại lai được tạo ra thường 
tích lũy ở pha tủa. Trong khi cảm ứng ở 23–
30°C, 30–90% protein tái tổ hợp thu được ở 
pha tan. Tăng trưởng và cảm ứng ở 25°C hoặc 
30°C có thể là tối ưu nếu sử dụng trình tự 
peptide tín hiệu của một số vector pET 
(Novagen). Chủng E. coli Rosetta1 
pET32a(+)_FLS tạo FLS biểu hiện ở dạng tan 
nhiều hơn chủng E. coli Rosetta2 pET32a(+)-
FLS. Do đó, chúng tôi tiến hành tối ưu nhiệt 
độ biểu hiện rFLS ở chủng E. coli Rosetta1 
pET32a(+)_FLS (hình 6). 
52,83 kDa
Hình 7. Tối ưu điều kiện thời gian để thu 
enzyme tái tổ hợp ở pha tan 
Ghi chú: w/o IPTG: Đối chứng không cảm ứng 
IPTG, TS: protein tổng số, S: protein pha tan, P: 
protein pha tủa, M: thang chuẩn protein. 
Kết quả trên hình 6 cho thấy lượng protein 
tái tổ hợp có kích thước khoảng 52,83 kDa 
biểu hiện khá nhiều ở nhiệt độ 37oC, 30oC và 
23
oC, đó chính là kích thước của rFLS theo 
tính toán lý thuyết. Ở nhiệt độ càng cao (30 và 
37
oC), lượng protein thu được càng lớn và 
càng nhiều ở pha tủa. FLS biểu hiện ở nhiệt 
độ thấp hơn (23oC), lượng protein đích ở 2 
pha là tương đương nhau. Trong một số 
trường hợp, cảm ứng kéo dài (qua đêm) ở 
nhiệt độ thấp (15–20oC) đã được chứng minh 
là nhiệt độ tối ưu thu nhận protein pha tan 
(Novagen). Cảm ứng biểu hiện khi giảm nhiệt 
độ cũng được chứng minh khi nghiên cứu 
biểu hiện gen mô hình GFP (Jiang et al., 
2013; Schein & Noteborn, 1988). Mặt khác, 
Hoang Thi Thu Yen et al. 
28 
nghiên cứu của Lin và đtg đã chỉ ra, E. coli 
BL21 chứa pET28a(+)_FLS tạo rFLS ở pha 
hòa tan nhiều hơn khi cảm ứng IPTG ở nhiệt 
độ 20oC so với 30oC (Lin et al., 2007). Do đó, 
chúng tôi lựa chọn nhiệt độ 16oC để cảm ứng 
biểu hiện và thu rFLS sau 24 và 48 giờ cảm 
ứng. Kết quả kiểm tra protein tổng số được 
thể hiện ở hình 7. 
Kết quả ở hình 7 cho thấy, khi hạ thấp 
nhiệt độ và kéo dài thời gian biểu hiện, lượng 
protein không bị giảm đi mà lượng protein ở 
pha tan còn nhiều hơn pha tủa, đặc biệt khi 
biểu hiện ở 48 giờ. 
KẾT LUẬN 
Gen FLS phân lập từ chè trung Du xanh 
được gắn thành công vào vector biểu hiện 
pET32a(+) và biến nạp vào vi khuẩn E. coli 
chủng Rosetta1 và Rosetta2. Nuôi các chủng 
vi khuẩn này ở 37oC và sử dụng IPTG 1mM 
cảm ứng biểu hiện, rFLS thu được có kích 
thước 52,83 kDa, tồn tại ở cả dạng không tan 
và dạng tan. Trong đó, chủng E. coli Rosetta1 
pET32a(+)_FLS tạo rFLS biểu hiện ở dạng tan 
nhiều hơn chủng E. coli Rosetta2 pET32a(+)-
_FLS. Tiếp theo, chủng E. coli Rosetta1 
pET32a(+)_FLS được tối ưu biểu hiện ở các 
nhiệt độ 30oC, 23oC và 16oC (24 và 48 giờ). 
Sau cảm ứng 48 giờ và nuôi ở 16oC, chủng E. 
coli Rosetta1 pET32a(+)_FLS tạo rFLS lượng 
lớn ở pha tan. 
TÀI LIỆU THA KHẢO 
Abrahams S., Tanner G. J., Larkin P. J. & 
Ashton A. R., 2002. Identification and 
biochemical characterization of mutants in 
the proanthocyanidin pathway in 
Arabidopsis. Plant Physiol., 130(2): 
561−576. 
Berger M. M., 2005. Can oxidative damage be 
treated nutritionally? Clinical Nutrition, 
24(2): 172−183. 
Britsch L., Heller W. & Grisebach H., 1981. 
Conversion of Flavanone to Flavone, 
Dihydroflavonol and Flavonol with an 
Enzyme System from Cell Cultures of 
Parsley. Z. Naturforsch, 36(c): 742−750. 
Butelli E., Titta L., Giorgio M., Mock H. P., 
Matros A., Peterek S., Schijlen E. G., Hall 
R. D., Bovy A. G., Luo J. & Martin C., 
2008. Enrichment of tomato fruit with 
health-promoting anthocyanins by 
expression of select transcription factors. 
Nat. Biotechnol., 26(11): 1301−1308. 
Cheng A. X., Han X. J., Wu Y. F. & Lou H. 
X., 2014. The function and catalysis of 2-
oxoglutarate-dependent oxygenases 
involved in plant flavonoid biosynthesis. 
Int J. Mol. Sci., 15(1): 1080−1095. 
Czemmel S., Stracke R., Weisshaar B., 
Cordon N., Harris N. N., Walker A. R., 
Robinson S. P. & Bogs J., 2009. The 
grapevine R2R3-MYB transcription factor 
VvMYBF1 regulates flavonol synthesis in 
developing grape berries. Plant Physiol., 
151(3): 1513−1530. 
Harbowy M. E. & Balentine D. A., 1997. Tea 
chemistry. Critical Reviews ill Plant 
Sciences, 16(5): 415−480. 
Havsteen B. H., 2002. The biochemistry and 
medical significance of the flavonoids. 
Pharmacol. Ther., 96(2-3): 67−202. 
He X., Zhao X., Gao L., Shi X., Dai X., Liu 
Y., Xia T. & Wang Y., 2018. Isolation 
and Characterization of Key Genes that 
Promote Flavonoid Accumulation in 
Purple-leaf Tea (Camellia sinensis L.). 
Sci. Rep., 8(1): 130. 
Hoang Thi Thu Yen, Mai Thi Huyen Trang, 
Pham Thi Hang & Huynh Thi Thu Hue, 
2017. Cloning and sequence analysis off 
gene encoding flavonol synthase from 
trung du teas growing in Thai Nguyen. 
Journal of Science VNU, 33(4): 127−136. 
Jiang X., Zhang H., Yang J., Liu M., Feng H., 
Liu X., Cao Y., Feng D. & Xian M., 
2013. Induction of gene expression in 
bacteria at optimal growth temperatures. 
Appl. Microbiol Biotechnol., 97(12): 
5423−5431. 
Jiang X., Zhang H., Yang J., Liu M., Feng H., 
Liu X., Cao Y., Feng D. & Xian M., 
2013. Induction of gene expression in 
bacteria at optimal growth temperatures. 
Appl. Microbiol. Biotechnol., 97(12): 
5423−5431. 
Expression of gene encoding flavonol synthase 
29 
Kim Y. B., Kim K., Kim Y., Tuan P. A., Kim 
H. H., Cho J. W. & Park S. U., 2014. 
Cloning and characterization of a flavonol 
synthase gene from Scutellaria 
baicalensis. Scientific World Journal, 
2014: 980740. 
Lin G. Z., Lian Y. J., Ryu J. H., Sung M. K., 
Park J. S., Park H. J., Park B. K., Shin J. 
S., Lee M. S. & Cheon C. I., 2007. 
Expression and purification of His-tagged 
flavonol synthase of Camellia sinensis 
from Escherichia coli. Protein Expr. 
Purif., 55(2): 287−292. 
Lukacin R. & Britsch L., 1997. Identification 
of strictly conserved histidine and arginine 
residues as part of the active site in 
Petunia hybrida flavanone 3beta-
hydroxylase. Eur. J. Biochem., 249(3): 
748−757. 
McKay D. L. & Blumberg J. B., 2002. The 
role of tea in human health: an update. J 
Am. Coll. Nutr., 21(1): 1−13. 
Pietta P. G., 2000. Flavonoids as 
Antioxidants. Joural of Natural Products, 
63(7): 1035−1042. 
Schein C. H. & Noteborn M. H. M., 1988. 
Formation of Soluble Recombinant 
Proteins in Escherichia Coli is Favored by 
Lower Growth Temperature. 
Bio/Technology, 6: 291–294. 
Tohge T., de Souza L. P. & Fernie A. R., 
2017. Current understanding of the 
pathways of flavonoid biosynthesis in 
model and crop plants. J. Exp. Bot., 
68(15): 4013−4028. 
Turnbull J. J., Nakajima J., Welford R. W., 
Yamazaki M., Saito K. & Schofield C. J., 
2004. Mechanistic studies on three 2-
oxoglutarate-dependent oxygenases of 
flavonoid biosynthesis: anthocyanidin 
synthase, flavonol synthase, and flavanone 
3beta-hydroxylase. J. Biol. Chem., 279(2): 
1206−1216. 
Vita J. A., 2005. Polyphenols and 
cardiovascular disease: effects on 
endothelial and platelet function. The 
American Journal of Clinical Nutrition, 
81(1): 292−297. 
Wang Y. S., Gao L. P., Shan Y., Liu Y. J., 
Tian Y. W. & Xia T., 2012. Influence of 
shade on flavonoid biosynthesis in tea 
(Camellia sinensis (L.) O. Kuntze). 
Scientia Horticulturae, 141: 7–16. 
Winkel-Shirley B., 2001. Flavonoid 
biosynthesis. A colorful model for 
genetics, biochemistry, cell biology, and 
biotechnology. Plant Physiol., 126(2): 
485−493. 
.