Tinh sạch và nuôi cấy tế bào diệt tự nhiên (NK) cho ứng dụng lâm sàng

 120 TCNCYH 112 (3) - 2018 
 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 
TINH SẠCH VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO DIỆT TỰ NHIÊN (NK) 
CHO ỨNG DỤNG LÂM SÀNG 
Natalia Lapteva1, Susann M. Szmania2, Frits van Rhee2, Cliona M. Rooney1 
1Trung tâm nghiên cứu Gene và Tế bào, Đại học Y Baylor, Houston, TX 77030; 
2Đại học Y Arkansas, Little Rock, AK 72205 
Người dịch: BS. Lương Hoàng Long 
Hiệu đính: TS.BS. Nguyễn Thanh Bình 
Trường Đại học Y Hà Nội 
*Bản dịch này người dịch đã cố gắng truyền tải thông tin một cách sát nghĩa và dễ hiểu nhất đến với bạn 
đọc. Tuy nhiên cũng có thể xảy ra sai sót do chưa thống nhất về một số thuật ngữ và khái niệm mới. Chúng 
tôi không chịu trách nhiệm về bất kỳ sai sót y khoa nào khi tham khảo, trích dẫn bài dịch này. Mọi thông tin 
chính xác và đầy đủ nhất xin xem bài báo nguyên gốc theo link dưới đây: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
pubmed/24941378 (Critical Reviews™ in Oncogenesis, 19(1 - 2): 121 – 132 (2014)). 
TÓM TẮT 
Tế bào diệt tự nhiên Natural Killer (NK) đã được chứng minh có vai trò quan trọng trong đáp ứng chống 
lại khối u và do đó đã được ứng dụng như là một liệu pháp miễn dịch trong điều trị ung thư. Trong nghiên 
cứu này chúng tôi khái quát các phương pháp hiện có dùng để kích hoạt, làm giàu, nhân dòng và vận 
chuyển các chế phẩm tế bào NK dùng cho mục đích lâm sàng. 
Từ khóa: tế bào diệt tự nhiên, sản xuất, sản phẩm lâm sàng 
Từ viết tắt: AML: Leukemia cấp dòng tủy; B-ALL: Leukemia cấp dòng lympho B; C-ALL: Leukemia cấp 
dòng lympho thông thường; H-SCT: Ghép tế bào gốc tạo máu; IL: interleukin; N/A: Không có thông tin; NK: 
Tế bào diệt tự nhiên; PBMC: Tế bào đơn nhân máu ngoại vi; SCGM: Môi trường nuôi cấy tế bào gốc. 
I. TỔNG QUAN 
Trong vòng 3 thập kỷ qua, đã có rất nhiều 
nỗ lực của các nhà nghiên cứu cơ bản và lâm 
sàng để làm sáng tỏ chức năng tế bào diệt tự 
nhiên NK trong đáp ứng miễn dịch chống lại 
các tế bào ung thư và để hiểu cơ chế hoạt 
động của chúng [1]. Các nghiên cứu này đã 
dẫn đến các thử nghiệm lâm sàng ứng dụng 
tế bào NK trong điều trị ung thư. Kết quả của 
các thử nghiệm lâm sàng đã cho thấy việc 
truyền tế bào NK là an toàn và có khả năng 
dung nạp tốt, đồng thời tế bào NK được 
truyền có khả năng duy trì với nồng độ cao ở 
người nhận trong vài tháng dẫn đến các đáp 
ứng trên lâm sàng [2 - 4]. Một phác đồ lý 
tưởng ứng dụng tế bào NK trên lâm sàng cần 
phải tạo ra được các tế bào NK có độ tinh 
sạch và tiềm năng với số lượng đủ lớn để có 
thể truyền nhiều lần cùng một sản phẩm. Tế 
bào NK được truyền cần phải có khả năng 
nhân lên ở người nhận và chống lại, tiêu diệt 
khối u. Một điều cần lưu ý nữa là tế bào NK có 
đặc tính kích hoạt miễn dịch chủ động, do đó 
có khả năng thu hút các tế bào miễn dịch, kích 
hoạt và nhân lên các tế bào T đặc hiệu với 
khối u. 
Địa chỉ liên hệ: Lương Hoàng Long, Trường Đại học Y 
Hà Nội 
Email: longluong.fsh@gmail.com 
Ngày nhận: 7/5/2018 
Ngày được chấp thuận: 30/6/2018 
 TCNCYH 112 (3) - 2018 121 
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 
II. NGUỒN TẾ BÀO NK VÀ CÁC QUY 
TRÌNH NUÔI CẤY 
Đa phần các thử nghiệm lâm sàng ứng 
dụng tế bào NK trong điều trị ung thư đều yêu 
cầu một lượng tế bào truyền lớn, khoảng 5 x 
106 đến 5 x 107 tế bào NK (CD3-CD56+) cho 1 
kilogram cân nặng bệnh nhân [2; 3; 5; 6]. Gần 
đây, có báo cáo đã sử dụng liều cao tới 1 x 
108 tế bào diệt tự nhiên (CD3-CD56+)/kg cân 
nặng [7]. Bởi vì tế bào NK chỉ chiếm tỷ lệ nhỏ 
trong quần thể tế bào bạch cầu (~1 - 20% so 
với ~80% của tổng số tế bào T và B), do đó có 
nhiều phương pháp đã được phát triển nhằm 
làm giàu từ một thể tích lớn máu ngoại vi, như 
chế phẩm phân tách máu (apheresis), hoặc 
nhân lên từ một lượng mẫu nhỏ hơn hoặc từ 
nguồn tế bào gốc (hình 1). 
Hình 1. Tế bào NK ứng dụng trên lâm sàng thường thu được từ chế phẩm 
phân tách máu tươi hoặc đông lạnh 
(A) Máy CliniMACS có thể làm giàu CD56+ bằng việc loại bỏ các dòng tế bào không phải tế 
bào diệt tự nhiên, chọn lọc dương tính sử dụng hạt từ gắn anti-CD56 hoặc cả hai phương pháp có 
thể được sử dụng để tăng độ tinh sạch tế bào NK. Sau khi trải qua làm giàu bằng CliniMACS, tế 
bào NK được truyền trực tiếp hoặc kích hoạt qua đêm bằng IL-2. Thay vào đó, tế bào NK có thể 
được nhân lên từ một lượng nhỏ chế phẩm phân tách máu in vitro sử dụng (B) hỗn hợp Cytokine 
hoặc (C) bổ sung tế bào nuôi để tăng hiệu quả nhân lên và giảm thời gian cần nuôi cấy để chế 
phẩm có thể truyền được. 
Các biện pháp tạo dòng tế bào NK dùng 
cho ghép đồng loại thường cố gắng loại bỏ 
dòng lympho T-CD3+ do chúng có khả năng 
gây hội chứng mảnh ghép chống vật chủ 
(Graft-vesus-host disease–GVHD) nên làm 
tăng nhu cầu số lượng tế bào cần ban đầu, 
nhất là khi khâu loại bỏ nằm cuối cùng trong 
quy trình [8]. Do đó, đa phần các quy trình sử 
dụng chế phẩm phân tách máu (apheresis) 
cần 1 - 20 x 109 tế bào đơn nhân làm nguyên 
Loại bỏ tế bào T&B hoặc 
làm giàu CD56+ bằng 
CliniMACS và hoạt hóa 
qua đêm với cytokines 
Chỉ có cytokines 
trong 4 - 10 tuần 
Với tế bào nuôi 
được tia xạ trong 
10 - 14 ngày 
Tế bào nuôi 
 122 TCNCYH 112 (3) - 2018 
 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 
liệu khởi đầu; tuy nhiên, có các quy trình phân 
tách từ các chế phẩm khác như từ lớp buffy 
coats, máu cuống rốn [9; 10]. Tế bào NK trong 
máu ngoại vi và từ chế phẩm phân tách máu 
có thể được xác định bằng máy đếm tế bào 
dòng chảy với các marker CD45+CD56+CD3- 
(hình 2). 
Hình 2. Xác định tế bào diệt tự nhiên trong chế phẩm 
phân tách máu bằng máy đếm tế bào dòng chảy 
Quần thể tế bào lympho/mono được đánh giá qua các bước (A) biểu đồ FSC và SSC và sau 
đó (B) định lượng các tế bào qua cổng CD45+ (C) tế bào NK được định danh là các tế bào 
CD56+CD3-. 
Trong phương pháp “nhanh”, tế bào NK 
được thu từ chế phẩm phân tách máu nhờ 1 
hoặc 2 lượt loại bỏ tế bào T-CD3+ sử dụng 
hạt từ CliniMACS gắn thụ thể anti-CD3 
(CliniMACS, hóa chất CD3), có thể có hoặc 
không kích hoạt qua đêm bằng IL-2 hoặc IL-
15 [11; 12]. Phương pháp này tạo được đến 
2 x 109 tế bào NK với độ tinh sạch 20%, do 
các tế bào B-CD19+ và tế bào Mono-CD14+ 
chiếm tới hơn 50% lượng sản phẩm. Việc loại 
bỏ tế bào B-CD19+ với hạt từ gắn kháng thể 
anti-CD19 (CliniMACS, hóa chất CD19) làm 
tăng thêm độ tinh sạch cho sản phẩm tế bào 
NK, dẫn đến độ tinh sạch của dòng 
CD56+CD3- vào khoảng 40%. Một cách khác 
để làm giàu tế bào NK là phân lập các tế bào 
CD56+ với hóa chất CliniMACS CD56 (kháng 
thể đơn dòng anti-CD56), có hoặc không có 
loại bỏ tế bào T-CD3+ [13; 14]. Không cần 
bước loại bỏ tế bào T-CD3+, phương pháp 
này có thể tạo ra sản phẩm tế bào NK có độ 
tinh sạch > 95% mà vẫn giữ lại các dòng tế 
bào CD56+CD3+ (tế bào T giống NK–NKT), 
cũng có khả năng góp phần vào đáp ứng 
miễn dịch chống lại khối u. Nếu loại trừ thêm 
tế bào CD3+ sẽ tạo ra sản phẩm có độ tinh 
sạch lên đến 99%. Tất cả các phương pháp 
phân tách trên đều dẫn đến giảm số lượng 
mong muốn của tế bào NK, do vậy việc đạt 
được độ tinh sạch cao cần phải cân bằng với 
tính hiệu quả và an toàn. 
Bởi các nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng 
sử dụng trong điều trị ung thư cần liều lượng 
tế bào NK lớn và nhiều lần truyền nên một lần 
lọc máu có thể chưa đủ số lượng tế bào NK 
yêu cầu. Do vậy, một số phương pháp phức 
tạp hơn nhằm nuôi cấy tế bào NK ngoài cơ 
thể đã được phát triển. Nuôi cấy tế bào NK 
với IL-2 hoặc IL-15 hoặc cả hai để tăng gấp 
1000 lần sản phẩm ban đầu cần thời gian nuôi 
cấy lên đến 12 tuần [16 - 18]. Thay vào đó, 
phương pháp nuôi cấy tế bào sử dụng “tế bào 
 TCNCYH 112 (3) - 2018 123 
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 
nuôi” (feeder cells) đem lại hiệu quả tốt hơn 
trong thời gian ngắn hơn, và tạo ra lượng lớn 
tế bào NK đủ để truyền trong vòng 10 - 14 
ngày [8]. Phương pháp “tế bào nuôi” yêu cầu 
sử dụng các cytokine cũng như các tế bào 
nuôi qua xử lý phóng xạ, ví dụ như dòng EBV 
- LCL hoặc dòng tế bào K562 biến đổi gene, 
để tạo ra lượng lớn tế bào CD3-56+ với độ 
tinh sạch trên 70% từ tế bào đơn nhân trong 
máu ngoại vi [8; 19; 20]. Berg và cộng sự đã 
phát triển một phương pháp trong đó tế bào 
NK CD3-CD56+ từ máu ngoại vi được nuôi 
cấy cùng với tế bào nuôi EBV-LCL trong môi 
trường X-VIVO 20 có bổ sung 10% huyết 
thanh người AB bất hoạt, 500 U/mL IL-2 và 2 
mM Glutamax. Tế bào NK nhân lên 490 ± 260 
lần trong vòng 21 ngày nuôi cấy với độ tinh 
sạch tế bào 84,3 ± 7,8% CD56+ [19]. 
Là một trong các trung tâm hỗ trợ sản xuất 
cho liệu pháp tế bào (PACT), nhóm của chúng 
tôi phụ trách sản xuất tế bào NK sử dụng điều 
trị các bệnh đa u tủy xương cho các nghiên 
cứu viên tại khoa Y Trường Đại học Arkansas. 
Chúng tôi đang áp dụng một kỹ thuật nhân 
dòng tế bào NK cải biến được mô tả bởi nhóm 
nghiên cứu của Dario Campana; sử dụng tế 
bào K562 biến đổi gene để biểu hiện 4-1BBL 
và biểu hiện IL-15 gắn màng (k562-41BBL- 
mbIL-15) làm tế bào nuôi [20; 21]. Chúng tôi 
đã tối ưu hóa quy trình này cho việc nuôi cấy 
tế bào NK trong máy G-Rex (Wilson Wolf 
manufacturing, Minneapolis, MN) và máy 
WAVE bioreactor (GE Healthcare Life Sci-
ences, Piscataway, NJ), tạo ra dòng tế bào 
NK được kích hoạt và có khả năng đáp ứng 
cao. Nguyên liệu ban đầu chúng tôi sử dụng 
là chế phẩm phân tách máu, trữ lạnh tại nồng 
độ ~5 x 107 tế bào có nhân/mL trong Plasma-
Lyte (CSS) với 10% dimethyl sulfoxide và 5% 
human albumin trong một số túi (3 - 5 túi) 70 - 
80 mL. Các túi trữ lạnh được chuyển từ địa 
điểm thử nghiệm lâm sàng tới địa điểm xử lý 
(Đại học Y Baylor, Bệnh viện Houston Meth-
odist và Bệnh viện Nhi Texas) ở Houston, 
Texas. Vào ngày bắt đầu của quy trình nuôi 
cấy, chúng tôi rã đông tế bào đã được phân 
tách, rửa trong PBS với 5% huyết thanh phôi 
bò (gấp 3 lần lượng dung dịch lưu trữ) và sử 
dụng cột Ficoll để loại bỏ tế bào chết và các 
tạp chất [22]. Môi trường nuôi cấy được thiết 
lập dựa trên số lượng tế bào diệt tự nhiên 
CD56+CD3- đếm được bằng máy đếm tế bào 
dòng chảy. Mỗi một bình G-Re x 100 (diện 
tích bề mặt 100 cm2, thể tích 40 mL) được cấy 
một lượng nhất định tế bào lọc chứa 5 x 106 tế 
bào NK kết hợp với 5 x 107 tế bào nuôi K562 - 
41BBL-mbIL-15 đã xử lý phóng xạ (100 Gy) 
với tỉ lệ tế bào NK so với tế bào K562 là 1: 10 
trong môi trường SCGM (CellGenix, Ports-
mouth, NH) chứa 10% FBS. 
Vào ngày thứ 6 hoặc 7 của chu trình nuôi 
cấy, tế bào NK được phân lập và định lượng 
bằng máy đếm tế bào dòng chảy để xác định 
sự nhân lên và số lượng tế bào NK. Thông 
thường, nếu nuôi cấy trong bình G-Rex, 
chúng tôi thu hoạch tế bào NK vào ngày thứ 8 
- 10. Ban đầu, quy trình yêu cầu một nồng độ 
nhỏ IL-2 vào khoảng 10U/mL để kích thích 
nhân dòng tế bào NK; tuy nhiên, để đánh giá 
xem với nồng độ IL-2 lớn hơn liệu có cho số 
lượng và chất lượng tế bào NK nhân lên lớn 
hơn hay không, chúng tôi đã thử nghiệm liều 
lên tới 1000 U/mL. Nồng độ IL-2 cao hơn đã 
không làm tăng khả năng nhân lên hay sức 
sống của tế bào NK, tuy nhiên biểu hiện của 
các thụ thể kích hoạt trên bề mặt tế bào tăng 
lên đáng kể và cải thiện khả năng đáp ứng 
của tết bào NK đối với tế bào ung thư OPM-2 
và tế bào K562 (hình 3, không thể hiện dữ liệu). 
 124 TCNCYH 112 (3) - 2018 
 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 
Hình 3. Tăng hiệu quả tiêu diệt tế bào ung thư OPM-2 bằng tế bào NK 
nhân lên cùng với tế bào K562-mbIL15 với liều cao (500 và 1000 U/mL) IL-2 
Nuôi cấy tế bào NK trong bình G-Rex có 
nhiều lợi thế hơn so với các túi và bình thông 
thường khác [23]. Bao gồm tăng sản lượng tế 
bào nhờ có sự trao đổi khí tốt hơn và giảm 
thiểu thiếu hụt chất dinh dưỡng, giảm thể tích 
dịch phải thu hoạch nhờ khả năng rút đi đến 
80% dịch thừa mà không gây ảnh hưởng đến 
tế bào trên bề mặt nuôi cấy. Với mật độ nuôi 
cấy khởi điểm của chúng tôi là 1,25 x 104/mL 
tế bào NK, cả quá trình nuôi cấy không yêu 
cầu thêm 1 lần thay thế môi trường nào. 
Thông thường một bình G-Rex100 có thể thu 
được lên đến 5 x 108 tế bào NK. Để đạt được 
số lượng tế bào lớn hơn cần nhiều bình G - 
Rex, điều này làm tăng giá thành và công sức 
bỏ ra. Do vậy, chúng tôi đã tối ưu quy trình 
nhân dòng tế bào NK trong máy WAVE biore-
actor khi cần số lượng tế bào NK cao hơn. 
Đầu tiên, một môi trường nuôi cấy tĩnh được 
thiết lập trong các túi với mật độ tế bào NK 3 - 
5 x 104/mL và tế bào K562-41BBL-mbIL-15 đã 
xử lý 100Gy phóng xạ (tỉ lệ 1: 10; NK: K562) 
trong môi trường SCGM với 10% FBS và 
500U/mL IL-2. Khi tổng lượng tế bào đạt 8 - 
10 x 105 tế bào/mL, các tế bào được đưa vào 
trong các túi WAVE phù hợp và pha loãng đến 
2 x 105 tế bào/mL trong môi trường mới. Môi 
trường được lắc nghiêng 6°, 6 lần một phút 
trong vòng 4 - 5 ngày và được thu hoạch bởi 
máy CellSaver5+ instrument (Haemonetics 
Corporation, Braintree, MA). Nuôi cấy đồng 
thời tế bào NK trong bình G - Rex và máy 
WAVE bioreactor cho sản phẩm có số lượng, 
chất lượng và tiềm năng tốt hơn (được đo 
bằng đánh giá kiểu hình và đánh giá độc tính). 
Tuy nhiên, máy WAVE tạo ra sản phẩm chứa 
ít tế bào T-CD3+ và nhiều tế bào CD56+CD3- 
hơn, có lẽ bởi tế bào T ưa môi trường tĩnh. 
Thử nghiệm lâm sàng đối với bệnh lý đa u tủy 
xương yêu cầu cả tế bào NK tự thân và đồng 
loại. Trong chế phẩm đồng loại, tế bào T-
CD3+ được loại bỏ (cũng như tế bào 
CD3+CD56+) bằng hóa chất CD3 CliniMACS, 
giảm nồng độ tế bào T-CD3+ từ 19 ± 9% 
xuống còn 0,4 ± 0,5% (n = 5). Việc loại bỏ này 
dẫn đến nồng độ tế bào CD3+CD56- thấp hơn 
5 x 105 tế bào/kg dùng cho sản phẩm truyền 
theo quy định lâm sàng. 
%
 ly
 g
iả
i đ
ặ
c 
h
iệ
u
 TCNCYH 112 (3) - 2018 125 
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 
Hình 4. So sánh sự nhân lên của tế bào NK trong bình G-Rex và máy WAVE bioreactor 
Tế bào máu đơn nhân ngoại vi từ người khỏe mạnh chứa 5x106 tế bào NK được nuôi cấy 
đồng thời với tế bào K562-41BBL-mbIL-15 trong vòng 9 ngày. Tế bào được chuyển qua máy 
WAVE trong ngày thứ 4 của chu trình nuôi cấy. (A,B,C) Quan sát được số lượng và số lần nhân 
lên tương tự nhau của tế bào NK trong bình G-Rex và môi trường WAVE. (D) Tiềm năng (diệt tế 
bào K562) của cả hai chế phẩm là tương đồng nhau. Số liệu được biểu diễn là của một bệnh 
nhân, sự nhân lên tương tự được quan sát ở trên 3 bệnh nhân. 
Mặc dù đã có nhiều tiến bộ trong công 
nghệ nuôi cấy và làm giàu tế bào NK, các yêu 
cầu thực tế khác như việc vận chuyển, các 
quy trình phức tạp cũng như chi phí lớn đã 
thúc đẩy việc phát triển các nguồn tế bào NK 
khác, trong đó có các dòng tế bào NK (NK cell 
lines). Dòng tế bào NK-92 người đầu tiên 
được tinh sạch bởi Klingemann và cộng sự, 
từ một bệnh nhân đa u tủy xương dòng tế NK 
[24]. Tế bào NK-92 có hoạt tính kháng khối u 
phổ rộng và có thể được nuôi cấy in vitro với 
IL-2 [24; 25]. Bởi các tế bào này là dòng tế 
bào đồng loại với khả năng nhân lên vô hạn, 
nên các tế bào này cần được xử lý phóng xạ 
trước khi truyền để đảm bảo an toàn. Chúng 
tôi đã tích hợp việc nuôi cấy tế bào NK-92 cho 
bình G - Rex và đã đạt được mức độ nhân lên 
200 lần với các thao tác tối thiểu trong vòng 4 
tuần nuôi cấy. 
III. VẬN CHUYỂN CÁC CHẾ PHẨM 
TẾ BÀO NK 
Việc tạo ra các chế phẩm tế bào trong các 
trung tâm chuyên biệt có lẽ sẽ trở thành 
“thường quy” trong tương lai. Với nhiệm vụ là 
một trung tâm hỗ trợ sản xuất cho liệu pháp tế 
bào, chúng tôi đã vận chuyển tế bào đến các 
vị trí thử nghiệm lâm sàng tại các bang khác 
nhau và đã tối ưu hóa để phù hợp cho việc 
vận chuyển tế bào qua đêm. Đầu tiên chúng 
tôi nghiên cứu khả năng vận chuyển tế bào 
NK đã được nhân lên ở điều kiện đông lạnh 
trong 10% DMSO, 40% HBSS and 40% albu-
min huyết tương người (chứa 25% HSA). 
S
ố
 lư
ợ
n
g
 N
K
 (
x1
0
6 )
S
ố
 lầ
n
 n
h
ân
 lê
n
 c
ủ
a
 N
K
Ngày 
Ngày 
%
 ly
 g
iả
i t
ế
 b
à
o
 K
5
6
2 
Ngày 
 126 TCNCYH 112 (3) - 2018 
 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 
Đáng chú ý là có hơn 70% tế bào sống sót 
trong vòng vài giờ sau rã đông không có độc 
tính tế bào. Tuy chức năng của chúng có thể 
phục hồi qua đêm trong môi trường IL-2 
nhưng khả năng sống của chúng giảm đáng 
kể. Hơn nữa, tế bào NK được rã đông không 
có khả năng nhân lên trong người bệnh [5]. 
Do vậy, chúng tôi đã tìm kiếm giải pháp vận 
chuyển tế bào NK với nồng độ tế bào 1 x 107 
tế bào/mL trong dung dịch đệm truyền Bumi-
nate 5% (Baxter, Deerfield, IL) ở nhiệt độ 
phòng từ 4 - 15°C (trên túi lạnh -20°C). Cách 
vận chuyển này đã cho phép việc truyền cho 
bệnh nhân ngay sau khi tế bào đến vị trí thử 
nghiệm lâm sàng. Trong thử nghiệm, tại địa 
điểm lâm sàng chúng tôi đếm số lượng tế bào, 
loại bỏ các tế bào thừa trong liều truyền và 
thực hiện các thử nghiệm tính tinh sạch và an 
toàn khác. Chúng tôi phát hiện các tế bào NK 
đã nhân lên được vận chuyển trong điều kiện 
nhiệt độ phòng hay đông lạnh trong túi vận 
chuyển Fenwal giữ được sức sống và tiềm 
năng > 90% trong vòng 48h sau khi pha chế 
và không xảy ra sự suy giảm số lượng tế bào 
(hình 5). Chúng tôi chọn cách vận chuyển chế 
phẩm tế bào trên các túi lạnh vì nhiệt độ được 
giữ ổn định hơn (nhiệt độ dao động từ 8 - 11°
C) trong suốt quá trình vận chuyển so với việc 
vận chuyển trong nhiệt độ phòng (dao động từ 
5 đến 21°C). 
Hình 5. Đánh giá sự nhân lên của tế bào NK được trữ đông và tế bào tươi 
(A,B) Tế bào NK được nhân lên và đông lạnh có sức sống tốt vài giờ sau khi rã đông, tuy 
nhiên khả năng diệt K562 giảm. Tế bào được trữ đông khôi phục tiềm năng qua một đêm ủ, tuy 
nhiên sức sống giảm. Tế bào NK pha chế tươi (N = 3) duy trì tiềm năng sau vận chuyển trong 
nhiệt độ môi trường hoặc trên túi đá lạnh (C). 
Mặc dù biện pháp này hiệu quả dưới góc 
độ sản xuất, nó cần có sự phối hợp nhịp 
nhàng với bệnh nhân và địa điểm lâm sàng. 
Có thể xảy ra tình huống bệnh nhân không đủ 
điều kiện để truyền khi mà chế phẩm đến nơi. 
Do vậy chúng tôi đã thử nghiệm khả năng vận 
%
 t
ế
 b
à
o
 N
K
 s
ố
n
g 
%
 ly
 g
iả
i t
ế 
bà
o 
K
56
2 
Tươi 
48h ở nhiệt độ phòng 
48h trên túi đá lạnh 
NK tươi 
NK đông lạnh 
NK đông lạnh/giã đông 
%
 ly
 g
iả
i t
ế 
bà
o 
K
56
2 
Trong vòng 1 giờ sau giã đông 
16 - 24 giờ sau giã đông 
 TCNCYH 112 (3) - 2018 127 
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 
chuyển tế bào NK trong các bình G-Rex chứa 
môi trường nuôi cấy. Trong trường hợp này, 
các tế bào có thể được giữ trong tủ nuôi 1 
hoặc 2 ngày trong lúc đợi truyền, cho phép sự 
linh hoạt tại các địa điểm lâm sàng. Phương 
pháp này tỏ ra khá hiệu quả, tuy nhiên khi vận 
chuyển trong môi trường nuôi cấy, các tế bào 
cần được giữ trên túi giữ nhiệt được làm ấm 
sẵn đến 37°C để tránh làm mất khả năng 
sống tế bào và việc các tế bào vón tụ với nhau 
(xảy ra nếu sử dụng túi lạnh). Hạn chế của 
phương pháp này đó là tại địa điểm lâm sàng 
cần có phòng tế bào có đủ khả năng rửa 
sạch, pha chế chế phẩm cuối cùng dùng cho 
truyền. 
IV. CÁC TIÊU CHUẨN ĐỐI VỚI CHẾ 
PHẨM TẾ BÀO NK NUÔI CẤY DÙNG 
TRÊN LÂM SÀNG 
Cũng như đối với bất kỳ một chế phẩm tế 
bào nào, tế bào NK cần phải đảm bảo các 
điều kiện cơ bản để truyền cũng như các điều 
kiện cụ thể riêng cho chế phẩm, các điều kiện 
này hiện chưa được chuẩn hóa. Điều kiện tiêu 
chuẩn cho các tế bào NK nuôi cấy của chúng 
tôi đối với các chế phẩm tự thân cần chứa ít 
nhất 50% tế bào CD56+CD3-, còn đối với các 
chế phẩm đồng loại cần độ tinh sạch lớn hơn 
70% tế bào CD56+CD3- và không quá 5 x 105 
tế bào T CD3+CD56 -/1 kg cân nặng bệnh 
nhân. Cần ít hơn 0,1% tạp nhiễm tế bào nuôi 
K562-41BBL-mbIL-15 trong sản phẩm cuối 
cùng được đo bằng máy đếm tế bào dòng 
chảy đồng thời khẳng định rằng tế bào nuôi 
không có khả năng nhân lên bằng quy trình 
“Click-iT assay” (Life Technologies, Grand 
Island, NY). Sự hòa hợp với người hiến được 
khẳng định bằng định typ các locus HLA-A và 
HLA-B. Đáng chú ý rằng chế phẩm tự thân 
cần được xử lý DNase (Bensonaze Nuclease 
ultrapure, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) trước 
khi tách DNA để loại bỏ DNA giải phóng từ 
các tế bào K562. Các chế phẩm đồng loại 
không cần trải qua xử lý DNase bởi chúng đã 
qua một bước làm sạch tế bào T-CD3+ bằng 
CliniMACS, đồng thời cũng làm sạch các vụn 
tế bào K562 ra khỏi chế phẩm. 
Chúng tôi cũng đánh giá tiềm năng của các 
tế bào NK sử dụng tế bào đích K562 trong 
kiểm nghiệm giải phóng Chromium51 tiêu 
chuẩn vì tế bào K562 bị tiêu diệt dễ dàng bởi 
cả các tế bào NK chưa được kích hoạt. Do đó, 
đây có lẽ không phải là một phép thử tin cậy 
và vì vậy sẽ tốt hơn nếu đánh giá hiệu quả 
bằng việc sử dụng tế bào đích là các tế bào 
ác tính thu được từ bệnh nhân. Tuy nhiên, tế 
bào u khó phân lập và nuôi cấy nên khó có thể 
được ứng dụng rộng rãi. 
Tóm lại, trong vòng 3 thập kỷ qua, đã có 
những tiến bộ đáng kể trong việc tạo ra các 
chế phẩm tế bào NK cho mục đích điều trị lâm 
sàng. Ngoài ra, các nghiên cứu lâm sàng và 
tiền lâm sàng được thực hiện để đánh giá đặc 
điểm sinh học, khả năng tồn tại, nhân lên và 
chức năng của các tế bào này trên mô hình 
chuột và trên bệnh nhân nhằm lựa chọn các 
chế phẩm phù hợp. Cơ chế của việc suy giảm 
số lượng các tế bào NK sau truyền vẫn chưa 
được hiểu rõ hoàn toàn và cần thêm nỗ lực để 
tạo ra các chế phẩm có khả năng nhân lên và 
tồn tại lâu dài trong cơ thể bệnh nhân. Khả 
năng nhân lên in vivo sẽ cần ít tế bào hơn khi 
truyền. Việc lựa chọn các cytokine bổ sung khi 
truyền chế phẩm diệt tự nhiên cũng cần thêm 
nhiều nghiên cứu. Các nghiên cứu cần hướng 
đến phát triển phương pháp đông lạnh tốt 
nhất cho các tế bào NK để có thể dùng cho 
nhiều lần truyền. Các nghiên cứu thử nghiệm 
 128 TCNCYH 112 (3) - 2018 
 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 
lâm sàng với tế bào NK trong tương lai nhiều 
khả năng sẽ tích hợp biến đổi gene để cải 
thiện và mở rộng mức độ đặc hiệu và chức 
năng. Ngoài ra khi kết hợp điều trị với tế bào T 
có thể tăng hiệu quả điều trị nhờ ưu điểm 
của tế bào NK là thu hút và kích thích hệ miễn 
dịch chủ động. Tất cả các nghiên cứu cần 
phải theo dõi tình trạng miễn dịch của bệnh 
nhân sau truyền nhằm đánh giá sự nhân lên 
của tế bào, sự tiết cytokine và đánh giá các 
marker chỉ điểm cho sự kích hoạt và đáp ứng 
miễn dịch. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. Boyiadzis M, Foon KA, Herberman RB 
(2006). NK cells in cancer immunotherapy: 
three decades of discovery. Discov Med, 6
(36), 243 – 248. 
2. Miller JS, Soignier Y, Panoskaltsis-
Mortari A, McNearney SA et al (2005). 
Successful adoptive transfer and in vivo 
expansion of human haploidentical NK cells in 
patients with cancer. Blood, 105(8), 3051 - 
3017. 
3. Bachanova V, Burns LJ, McKenna DH 
et al (2010). Allogeneic natural killer cells for 
refractory lymphoma. Cancer Immunol Immu-
nother, 59(11), 1739 – 1744. 
4. Basse PH, Whiteside TL, Chambers 
W, Herberman RB (2001). Therapeutic activ-
ity of NK cells against tumors. Int Rev Immu-
nol, 20(3-4), 439 – 501.. 
5. Szmania S, Garg TK, Lapteva N, Lingo 
JD, Greenway AD et al (2012). Fresh ex vivo 
expanded natural killer cells demonstrate ro-
bust proliferation in vivo in high-risk relapsed 
multiple myeloma (MM) patients. Blood; ASH 
Annual Meeting Abstract; 2012. 
6. McKenna DH, Jr, Sumstad D, Bostrom 
N, Kadidlo DM et al (2007). Good manufac-
turing practices production of natural killer 
cells for immunotherapy: a six-year single-
institution experience. Transfusion, 47(3), 520
– 528. 
7. Smith A, Khuu H, Betters DM, Cook L 
et al (2010). Adoptive transfer of escalating 
doses of ex vivo expanded autologous natural 
killer (NK) cells in patients with advanced ma-
lignancies following bortezomib treatment to 
sensitiza to NK - TRAIL Cytotoxicity. Blood; 
ASH Annual Meeting Abstract; 2010. Abstract 
4296. 
8. Lapteva N, Durett AG, Sun J, Rollins 
LA et al (2012). Large-scale ex vivo expan-
sion and characterization of natural killer cells 
for clinical applications. Cytotherapy, 14(9), 
1131 - 1143. 
9. Spanholtz J, Preijers F, Tordoir M, 
Trilsbeek C et al (2011). Clinical-grade gen-
eration of active NK cells from cord blood he-
matopoietic progenitor cells for immunother-
apy using a closed-system culture proc-
ess. PLoS One, 6(6), e20740. 
10. Knorr DA, Ni Z, Hermanson D, 
Hexum MK, Bendzick L et al (2013). Clinical-
scale derivation of natural killer cells from hu-
man pluripotent stem cells for cancer ther-
apy. Stem Cells Transl Med, 2(4), 274 – 283. 
11. Pfeiffer MM, Schumm M, Muller I, 
Handgretinger R, Lang P (2012). IL-15-
stimulated CD3/CD19-depleted stem-cell 
boosts in relapsed pediatric patients after hap-
loidentical SCT. Leukemia, 26(11), 2435 – 
2439. 
12. Shi J, Tricot G, Szmania S, Rosen N 
et al (2008). Infusion of haplo-identical killer 
immunoglobulin-like receptor ligand mis-
matched NK cells for relapsed myeloma in the 
setting of autologous stem cell transplanta-
tion. Br J Haematol, 143(5), 641 – 653. 
 TCNCYH 112 (3) - 2018 129 
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 
13. Passweg JR, Tichelli A, Meyer-
Monard S et al (2004). Purified donor NK-
lymphocyte infusion to consolidate engraft-
ment after haploidentical stem cell transplanta-
tion. Leukemia, 18(11), 1835 - 1838. 
14. Koehl U, Esser R, Zimmermann S, 
Tonn T et al (2005). Ex vivo expansion of 
highly purified NK cells for immunotherapy 
after haploidentical stem cell transplantation in 
children. Klin Padiatr, 217(6), 345 - 350. 
15. Klingemann H, Grodman C, Cutler E, 
Duque M et al (2013). Autologous stem cell 
transplant recipients tolerate haploidentical 
related-donor natural killer cell-enriched infu-
sions. Transfusion, 53(2), 412 - 418. 
16. Klingemann HG, Martinson J (2004). 
Ex vivo expansion of natural killer cells for 
clinical applications. Cytotherapy, 6(1), 15 - 22. 
17. Carlens S, Gilljam M, Chambers BJ, 
Aschan J et al (2001). A new method for in 
vitro expansion of cytotoxic human CD3-
CD56+ natural killer cells. Hum Immunol, 62
(10), 1092 – 1098. 
18. Koehl U, Sorensen J, Esser R, 
Zimmermann S et al (2004). IL - 2 activated 
NK cell immunotherapy of three children after 
haploidentical stem cell transplantation. Blood 
Cells Mol Dis, 33(3), 261 – 6. 
19. Berg M, Lundqvist A, McCoy P, Jr, 
Samsel L et al (2009). Clinical-grade ex vivo-
expanded human natural killer cells up-
regulate activating receptors and death recep-
tor ligands and have enhanced cytolytic activ-
ity against tumor cells. Cytotherapy, 11(3), 341
– 355. 
20. Fujisaki H, Kakuda H, Shimasaki N, 
Imai C et al (2009). Expansion of highly cyto-
toxic human natural killer cells for cancer cell 
therapy. Cancer Res, 69(9), 4010 – 4017. 
21. Imai C, Iwamoto S, Campana D 
(2005). Genetic modification of primary natural 
killer cells overcomes inhibitory signals and 
induces specific killing of leukemic 
cells. Blood, 106(1), 376 - 83. 
22. Boyle W, Chow A (1969). Isolation of 
human lymphocytes by a Ficoll barrier 
method. Transfusion, 9(3), 151 – 155. 
23. Lapteva N, Vera JF (2011). Optimiza-
tion manufacture of virus- and tumor-specific T 
cells. Stem Cells Int, 2011: 434392. 
24. Gong JH, Maki G, Klingemann HG 
(1994). Characterization of a human cell line 
(NK - 92) with phenotypical and functional 
characteristics of activated natural killer 
cells. Leukemia, 8(4), 652 – 658. 
25. Tonn T, Schwabe D, Klingemann HG, 
Becker S et al (2013). Treatment of patients 
with advanced cancer with the natural killer 
cell line NK - 92. Cytotherapy, 15(12), 1563 – 
1570.